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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：秦永丽孙恩成耿宏伟徐青元杨涛赵晶王文世魏鹏冯瑜菲李俊平李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链RNA片段组成,共编码11种蛋白,七种结构蛋白(VP1-VP7)和四种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。其

关键词：抗原表位 VP2 单克隆抗体制备

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蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：王文世孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲魏鹏张翠云李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝... 详细信息

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝,因此命名为蓝舌病。蓝舌病VP7蛋白位于病毒颗粒内衣壳的最外侧,约占病毒成分的36%,是主要的血清群特异性抗原,因此获得针对VP7蛋白的单克隆抗体,就为蓝舌病免疫学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：单克隆抗体 BTV 群特异性抗原 VP7 生物学特性杂交瘤细胞株特异性反应

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蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：王文世张翠云李文京吴东来孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲魏鹏中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部兽医公共卫生重点开放实验室，哈尔滨 150001 中国动物疫病预防控制中心，北京 100125

为建立BTV特异性诊断方法和研究VP7蛋白功能，以目前国内流行的优势血清型病毒BTVl6免疫Balb／c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合，同时用BTVl6为包被抗原，建立间接ELISA方法进行筛选，并用有限稀释法进行克隆，最终获得... 详细信息

为建立BTV特异性诊断方法和研究VP7蛋白功能，以目前国内流行的优势血清型病毒BTVl6免疫Balb／c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合，同时用BTVl6为包被抗原，建立间接ELISA方法进行筛选，并用有限稀释法进行克隆，最终获得两株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(IB7、IVA4)。将本实验室保存分别编码BTVl6十个基因片段的真核重组pCI-neo质粒分别转染BHK-21细胞，进行免疫荧光鉴定，免疫荧光和Western Blot结果均显示两株单克隆抗体均与BTVl6 VP7蛋白发生特异性反应。间接免疫荧光(IFA)结果显示，两株单克隆抗体与BTV 24个血清型呈不同反应谱系。

关键词：蓝舌病病毒 VP7蛋白单克隆抗体抗体制备生物学特性

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抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：魏鹏孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲王文世张翠云吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室东北农业大学动物医学学院湖南农业大学动物医学学院

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型蓝舌病病毒(BTV1)免疫BALB/c鼠,4次免疫后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10... 详细信息

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型蓝舌病病毒(BTV1)免疫BALB/c鼠,4次免疫后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4、4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及Western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。进一步利用IFA对3株MAb的反应特异性进行鉴定,结果表明3株MAb与24个血清型的BTV均可反应。本实验室制备所得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒单克隆抗体 VP6蛋白 VP7蛋白

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西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建

西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：张翠云孙恩成刘霓红杨涛徐青元赵晶秦永丽冯瑜菲魏鹏王文世吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室湖南农业大学动物医学学院东北农业大学动物医学学院

西尼罗热是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)引起的,通过蚊子传播的一种急性人畜共患传染病。此病毒可对人和动物构成严重威胁,并可导致严重的公共卫生问题。因此迫切需要研制一种高效、安全、廉价的新型疫苗来控制该病的流行。腺病... 详细信息

西尼罗热是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)引起的,通过蚊子传播的一种急性人畜共患传染病。此病毒可对人和动物构成严重威胁,并可导致严重的公共卫生问题。因此迫切需要研制一种高效、安全、廉价的新型疫苗来控制该病的流行。腺病毒载体以其安全高效,宿主范围广的特点,成为一种广泛应用的病毒载体,近年来在活载体疫苗的研制中得到了广泛的应用,并已获得良好的免疫效果。WNV膜蛋白(Envelope,E)是WNV主要的抗原结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是决定病毒毒力的主要因素。为构建表达西尼罗病毒E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV-E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化到含有人5型缺陷腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞中,通过细菌内同源重组构建含有WNV-E基因pAD-WNV-E质粒的重组腺病毒,经PacⅠ酶切线性化后通过脂质体介导转染入人胚肾细胞AD-293细胞,获得重组腺病毒rpAD-WNV-E经PCR、Western blot及IFA鉴定,WNV-E蛋白在AD-293细胞中成功表达。经病毒滴度测定、一步生长曲线等实验发现该重组腺病毒与野生型腺病毒复制能力相近,但病毒滴度略低。本实验成功构建了表达WNV-E蛋白的重组腺病毒,可为后续研制WNV-E重组腺病毒疫苗奠定基础。

关键词：西尼罗病毒 E蛋白重组腺病毒

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尼帕病毒G和F蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 898-901页

作者：苏华温志远吴超王喜军胡森陈伟业葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为制备抗尼帕病毒(NiV)G和F蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以表达NiV G和F蛋白的真核重组表达质粒pCAGG-NiVG和pCAGG-NiVF分别免疫BALB/c小鼠,采用常规技术制备杂交瘤细胞;以表达G和F蛋白的重组牛痘病毒(rWR-NiVG、rWR-NiVF)分别感染BHK... 详细信息

为制备抗尼帕病毒(NiV)G和F蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以表达NiV G和F蛋白的真核重组表达质粒pCAGG-NiVG和pCAGG-NiVF分别免疫BALB/c小鼠,采用常规技术制备杂交瘤细胞;以表达G和F蛋白的重组牛痘病毒(rWR-NiVG、rWR-NiVF)分别感染BHK细胞,通过间接免疫荧光(IFA)筛选阳性克隆,分别得到一株抗G和抗F蛋白的MAb,命名为G3E9和F2G1。两株MAb均为IgM亚型/κ链。IFA检测G3E9和F2G1杂交瘤细胞诱导的小鼠腹水中IgM抗体效价均为1∶1 024。细胞融合抑制试验表明两株MAb均具有抑制NiV G和F蛋白共表达诱导细胞融合的功能;并且采用表达NiV G和F蛋白的水泡性口炎伪型病毒进行的中和试验表明两株MAb具有一定的中和活性。

关键词：尼帕病毒 G和F蛋白细胞融合单克隆抗体

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糖蛋白G基因在基因组P-M位的插入重组表达对狂犬病毒Flury LEP致病力的影响

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微生物学报 2011年第8期51卷 1098-1105页

作者：翟洪月陶丽红葛金英王喜军冯娜帅磊马良步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对... 详细信息

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对重组病毒的生物学特性及对小鼠的致病性进行了初步研究。【结果】亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×106 FFU/mL和2.5×106 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×107 FFU/mL和2.5×107 FFU/mL;嗜神经指数均为1;Western blot显示,rLEP-PGM在感染细胞的G蛋白表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的LD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的LD50分别为4×104 FFU和3.2×105 FFU。【结论】P、M基因之间插入一个额外的G基因能够提高G蛋白的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入中枢神经系统的能力。

关键词：反向遗传技术狂犬病毒重组表达糖蛋白致病性

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蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第6期33卷 465-470页

作者：王凌凤杨涛孙恩成耿宏伟秦永丽赵晶蔡绪禹刘霓红李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国动物疫病预防控制中心北京100125

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳... 详细信息

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10。Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/κ链。Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应。利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546。本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒血清17型 VP2 原核表达单克隆抗体抗原表位

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原核表达山羊布氏杆菌M5-90VirB12蛋白及其在检测中的初步应用

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 293-296页

作者：高宇哲胡森乔祖健刘林涛杨帆步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了*** M5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的VirB12重组蛋白为抗... 详细信息

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了*** M5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的VirB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份***临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于***感染的血清检测,为进一步建立*** M5-90virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法。

关键词：山羊布氏杆菌 M5-90菌株 virB12基因原核表达间接ELISA

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抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 893-897页

作者：赵晶孙恩成刘霓红杨涛杨银辉耿宏伟秦永丽王凌凤徐青元吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物/生物安全国家重点实验室北京100071

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a... 详细信息

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11。Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应。利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33(321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位。本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础。

关键词：东方马脑炎病毒 E2蛋白原核表达真核表达单克隆抗体抗原表位

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