检索结果-内蒙古大学图书馆

中国免疫学杂志 2011年第6期27卷 529-532页

作者：马健男杨涛徐青元孙恩成林燕刘霓红杨银辉李文京步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国动物疫病预防控制中心北京100125

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方... 详细信息

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1。这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

关键词：西尼罗病毒 NS1蛋白单克隆抗体

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表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其中和抗体检测方法的应用

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 665-670页

作者：李晓艳葛金英哈斯苏荣王琪焦丽红王永步志高内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 哈尔滨医科大学公共卫生学院黑龙江哈尔滨150081 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

人偏肺病毒(hMPV)是最新发现的与呼吸道疾病有关的病原体。为构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的B型重组hMPV,本研究利用反向遗传学技术,以表达EGFP的hMPV NL/1/99株全长cDNA质粒重组pPS-hMPV-EGFP,及其4种辅助重组质粒pCITE-N、pCITE-... 详细信息

人偏肺病毒(hMPV)是最新发现的与呼吸道疾病有关的病原体。为构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的B型重组hMPV,本研究利用反向遗传学技术,以表达EGFP的hMPV NL/1/99株全长cDNA质粒重组pPS-hMPV-EGFP,及其4种辅助重组质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L、pCITE-M2.1为基础,共转染BHK-21细胞进行重组病毒的拯救。鉴定结果表明拯救的重组病毒rhMPV-NL-EGFP高效表达外源基因EGFP。rhMPV-NL-EGFP与亲本病毒株具有相似的生物学特性,生长滴度可达106.7 TCID50/mL。rhMPV-NL-EGFP在细胞中连续传代10代仍然维持外源基因的高效和稳定表达,病毒滴度于室温条件下可维持长时间稳定。分别利用亲本病毒株和重组病毒rhMPV-NL-EGFP进行免疫小鼠血清中和抗体检测,结果显示两种方法具有较好的相似性(p>0.05)。本研究为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法,同时为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础。

关键词：人偏肺病毒反向遗传技术病毒拯救绿色荧光蛋白

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抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第10期33卷 816-819页

作者：秦永丽孙恩成耿宏伟杨涛刘霓红赵晶王凌凤徐青元蔡绪禹李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国动物疫病预防控制中心北京100125

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb)。并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌... 详细信息

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb)。并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12)。Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应。间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应谱系。本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据。

关键词：蓝舌病病毒 VP7蛋白 NS2蛋白单克隆抗体

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5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2011年第2期33卷 118-121页

作者：蔡绪禹康晓平刘洪李裕昌孙恩成王凌凤杨涛刘霓红步志高李文京杨银辉吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物/生物安全国家重点实验室北京100071 中国动物疫病预防控制中心北京100125

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过... 详细信息

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段。

关键词：流行性乙型脑炎病毒森林脑炎病毒东方马脑炎病毒西方马脑炎病毒基孔肯雅病毒多重RT-PCR

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C型口蹄疫结构蛋白VP3的原核表达及生物活性

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江苏农业科学 2011年第4期39卷 38-40页

作者：刘文倩王猛张奕强刘永生张杰中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046 四川农业大学动物生物技术中心四川雅安625014

利用PCR扩增技术,以本实验室构建的C型口蹄疫pMD-P1重组质粒为模板扩增C型口蹄疫VP3片段,并连接到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建阳性质粒pGEX-VP3并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。使用不同IPTG浓度进行诱导,收集菌液进行SDS-PAGE。使用Mod... 详细信息

利用PCR扩增技术,以本实验室构建的C型口蹄疫pMD-P1重组质粒为模板扩增C型口蹄疫VP3片段,并连接到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建阳性质粒pGEX-VP3并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。使用不同IPTG浓度进行诱导,收集菌液进行SDS-PAGE。使用Model 422 Electro-Eluter切胶回收目的蛋白,并进行Western-Blotting分析。结果得到50 ku左右目的条带,证实融合蛋白VP3大肠杆菌中得到以包涵体形式表达,且使用切胶回收后的蛋白能被C型口蹄疫阳性血清识别,具有良好的反应原性。

关键词： C型口蹄疫结构蛋白VP3 原核表达生物活性

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西尼罗病毒NSl蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

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中国免疫学杂志 2011年第6期27卷 529-532页

作者：马健男杨涛徐青元孙恩成林燕刘霓红杨银辉李文京步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物炎全国家重点实验室北京100071 中国动物疫病预防控制中心北京100125

目的：制备针对西尼罗病毒NSl蛋白的特异性单克隆抗体。方法：以原核表达的重组NSI蛋白为免疫原，免疫BALB／c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2／O细胞进行融合。以真核表达的重组NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA... 详细信息

目的：制备针对西尼罗病毒NSl蛋白的特异性单克隆抗体。方法：以原核表达的重组NSI蛋白为免疫原，免疫BALB／c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2／O细胞进行融合。以真核表达的重组NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法筛选分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果：共获得了2株稳定分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为WN-1CIO和WN-3D10，其亚类鉴定分别属于IgG2z和IgG1o这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NSl蛋白和病毒抗原发生特异性反应，而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论：本实验成功制备出针对西尼罗病毒NSI蛋白的特异性单克隆抗体，为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

关键词：西尼罗病毒 NSl蛋白单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2010年第10期32卷 741-746页

作者：张维军田野林燕王群徐青元孙庆歌刘霓红杨涛田志军步志高童光志李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 中国动物疫病预防控制中心北京100125

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质... 详细信息

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 M蛋白重组牛痘病毒

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茨城病病毒S7基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2010年第7期32卷 537-541页

作者：张文龙殷喆吴东来王君伟东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立以茨城病病毒(IBAV)VP7蛋白为诊断抗原的茨城病(IBAD)血清学检测方法,本研究克隆了VP7蛋白抗原性、亲水性较强部分的编码基因,并在原核表达系统中表达了可溶性截短VP7蛋白。用截短VP7蛋白建立了IBAV间接ELISA检测方法。确定的阳... 详细信息

为建立以茨城病病毒(IBAV)VP7蛋白为诊断抗原的茨城病(IBAD)血清学检测方法,本研究克隆了VP7蛋白抗原性、亲水性较强部分的编码基因,并在原核表达系统中表达了可溶性截短VP7蛋白。用截短VP7蛋白建立了IBAV间接ELISA检测方法。确定的阳性血清的判定标准为不低于0.32。特异性试验表明建立的ELISA方法可以特异性检测IBAV阳性血清。建立的ELISA方法与中和试验结果比较,符合率为77%。用建立的ELISA方法检测70份来自云南的牛血清样品进行检测,IBAV血清阳性率为45.7%。该方法的建立为IBAD的诊断提供了一种简单快速的辅助手段。

关键词：茨城病截短VP7蛋白间接ELISA

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鸡IFN-γ DNA壳聚糖纳米粒的制备及外源基因表达

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中国预防兽医学报 2010年第7期32卷 559-562页

作者：殷喆张文龙刘霓红杨涛步志高王君伟吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为检测纳米载体对表达重组质粒的保护效果,本实验构建了鸡γ干扰素(IFN-γ)真核表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ;并将其与200μg/mL壳聚糖醋酸溶液制备成DNA/壳聚糖纳米颗粒(CNPs)。透射电镜观察CNPs呈不规则球形,光子相关色谱(PCS)仪测定... 详细信息

为检测纳米载体对表达重组质粒的保护效果,本实验构建了鸡γ干扰素(IFN-γ)真核表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ;并将其与200μg/mL壳聚糖醋酸溶液制备成DNA/壳聚糖纳米颗粒(CNPs)。透射电镜观察CNPs呈不规则球形,光子相关色谱(PCS)仪测定显示CNPs的平均粒径为172.6nm±5.1nm;Zeta电位为20.8mV±2.9mV;CNPs重组质粒包埋效率和载药量分别为91.21%±2.54%和31.93%±0.16%。鸡胚成纤维细胞(CEF)体外转染实验表明:携带的外源基因能在CEF中释放、表达,其表达效率约为阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染后的16.3%,同时CNPs对细胞基本无毒性。CNPs稳定实验也证实其稳定性良好。

关键词：壳聚糖纳米颗粒鸡γ-干扰素基因体外转染

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表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

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中国预防兽医学报 2010年第8期32卷 581-585页

作者：华涛陶丽红葛金英王喜军沈向真步志高南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室黑龙江哈尔滨150001

为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了RVFlury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(... 详细信息

为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了RVFlury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP)。rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP)在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异。rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代次重组病毒均稳定表达EGFP。重组表达的EGFP可用于中和抗体检测,rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA)或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度,两种检测结果显示较好的相似性(p>0.05)。本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础,并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法。

关键词：狂犬病病毒 Flury-LEP株 EGFP 反向遗传操作多价疫苗病毒中和抗体

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