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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2016年第3期44卷 1-10页

作者：黄建龙谭丹王昌建张朝阳何世成朱春霞汪洪冰邓国华刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制... 详细信息

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。

关键词： H9N2亚型禽流感遗传进化洞庭湖区湖南省

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表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

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中国预防兽医学报 2016年第4期38卷 266-270页

作者：刘璐丁蕾蕾柳金雄陈普成李爱心胡玉珍姜永萍陈化兰孙晓林甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。

关键词：禽流感病毒 HA蛋白重组鸭瘟病毒信号肽跨膜区

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Clade7．2H5N1亚型禽流感重组病毒疫苗株的构建及免疫效力评价

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中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 580-584页

作者：宋洋铭谷春阳曾显营邓国华杨孝朴陈化兰甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8... 详细信息

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。

关键词： H5N1 禽流感病毒反向遗传操作系统疫苗株免疫效力评价

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两株EA H1N1亚型猪流感病毒在豚鼠体内的复制和传播能力评估

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中国预防兽医学报 2016年第3期38卷 190-193页

作者：陶世宇王增陈艳杨焕良孔晖晖陈化兰胡永浩甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为评价欧亚类禽H1N1(EA H1N1)亚型猪流感病毒(SIV)在哺乳动物间呼吸道飞沫的传播能力,本研究选取A/swine/Henan/11/2005(H1N1)(He N11)和A/swine/Hunan/26/2010(H1N1)(HuN26)为代表病毒株,以106EID50/300μL的剂量,经鼻腔分别感染3只豚鼠,24 h后在相邻笼内分别放入3只豚鼠作为传播组,通过检测鼻洗液内的病毒滴度评价2株病毒在豚鼠间呼吸道飞沫的传播能力;并以相同剂量分别感染2只豚鼠,感染72 h后通过检测脏器内病毒滴度评价2株病毒在豚鼠体内的复制能力。传播试验结果表明,HeN11株在豚鼠间的传播能力为3传1,HuN26株为3传3。脏器中病毒滴定结果表明,HeN11株在下呼吸道具有良好的复制能力,而HuN26株主要在上呼吸道复制。进一步的氨基酸差异分析表明,2株病毒株共有62个氨基酸差异。以上结果表明,2株病毒株均能够在豚鼠呼吸道内进行不同程度的复制,而呼吸道飞沫传播能力显著不同。本实验为进一步研究EA H1N1 SIV在哺乳动物间呼吸道飞沫传播的分子机制奠定基础,也为猪流感的防控提供了实验依据。

关键词： EA H1N1 猪流感病毒豚鼠复制传播

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流感病毒NP蛋白与宿主蛋白CAP1相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 513-517页

作者：姜水涛赵玉辉周圆罗维玉张杰李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Aden... 详细信息

流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Adenylate cyclase-associated protein 1(CAP1),并通过酵母回交验证、免疫共沉淀技术(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与CAP1之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与CAP1共定位于A549细胞的细胞质内。在HEK293T细胞中过表达CAP1蛋白后,流感病毒的复制能力下降,表明CAP1对流感病毒复制具有抑制作用。本研究对该蛋白的鉴定为流感病毒的复制机理研究奠定了基础。

关键词：酵母双杂交 NP蛋白 CAP1蛋白相互作用

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蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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甘肃农业大学学报 2016年第1期51卷 7-12页

作者：张涛罗维玉姜水涛朱鹏阳李呈军陈化兰孙晓林姜丽甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21... 详细信息

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.

关键词： PKR 原核表达蛋白纯化多克隆抗体

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猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

猪肺炎支原体168株感染诱导差异表达蛋白的筛选及鉴定

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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：王宏恩邵国青冯志新熊祺琰于岩飞张映辛九庆刘茂军江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的主要致病菌.毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色,但目前对毒力因子知之甚少.本研究通过对感染前后猪肺炎支原体168 强毒株进行差异蛋白质组学分析,筛选出一些可能的毒力因子.试验首先用猪肺炎支原体168 强毒株体外感染猪气管上皮细胞(STEC),根据上清支原体含量来筛选出适宜的感染时间.结果显示,与其他感染条件相比,感染剂量为1×108,感染时间为48h 时上清中支原体含量最多.根据筛选出的感染剂量及感染时间进一步感染,利用双向电泳技术(Two-dimensionalElectrophoresis,2-DE)对感染前后的全菌蛋白进行分离,PDQuest V8.0 软件对扫描所得图像进行分析(T 检验法,差异＞1.5 倍),强毒株感染组与对照组蛋白点进行比对分析后,发现了11 个差异蛋白,经过质谱鉴定7 个为支原体蛋白,其中3 个只出现在感染组中,4 个在感染后表达上调.从这些差异蛋白点中选择了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行了Western-blot 验证,结果显示,GAPDH 蛋白在强毒株感染后表达上调,与双向电泳结果一致.

关键词：猪肺炎支原体168株双向电泳差异蛋白 Western-blot

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一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析

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中国动物检疫 2016年第4期33卷 77-79,93页

作者：兰玲王涛王晶程子兵邓国华陈化兰新疆动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830011 塔城市动物疫控中心新疆塔城834300 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究对2014年从新疆额敏县分离到的一株野鸟源H3N8亚型流感病毒A/wild bird/Xinjiang/S3525/2014(H3N8)进行了全基因序列和进化分析。序列分析显示,HA裂解位点序列为^(339)PEKQTR-GLFG^(348),为典型的低致病性禽流感病毒特征,NA基因具... 详细信息

本研究对2014年从新疆额敏县分离到的一株野鸟源H3N8亚型流感病毒A/wild bird/Xinjiang/S3525/2014(H3N8)进行了全基因序列和进化分析。序列分析显示,HA裂解位点序列为^(339)PEKQTR-GLFG^(348),为典型的低致病性禽流感病毒特征,NA基因具有6个潜在的糖基化位点,与病毒株A/mallard/Czech Republic/14333-1K/2011(H3N8)核苷酸高度同源(97.7%)。该毒株的内部基因来源较复杂,其PB1、NP基因分别与A/ruddy shell duck/Mongolia/921C2/2009(H7N1)和A/wild duck/Korea/MHC39-26/2011(H7N9)的同源性最高,其余内部基因与H2、H3、H6、H7等亚型禽流感病毒分离株同源性最高,呈现明显的异源性。除PB2基因外,其余基因片段均来源于野鸟源禽流感病毒。

关键词：流感病毒 H3N8亚型基因组分析

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湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

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中国动物检疫 2016年第1期33卷 9-12页

作者：宋跃君谭丹邓国华王昌建朱春霞张朝阳刘道新黄建龙湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律,为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据,对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行... 详细信息

为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律,为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据,对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株HA裂解位点为PQIETR↓GLF,均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒;5株病毒的HA和NA潜在的糖基化位点有一些差别,这些差别是否会引起其毒力和致病力上的差异还有待研究;从基因遗传进化关系来看,这些毒株与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。

关键词： H6N6亚型禽流感同源性遗传进化

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一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征

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中国农业科学 2015年第15期48卷 3071-3078页

作者：徐汇洋许榜丰陈艳隋金钰杨焕良尹航杨大为乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems... 详细信息

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500x L Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主(猪和人)上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个(N27、N40、N212和N291)位于HAl区,2个(N498和N557)位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个(N50、N58、N63和N68)在链接区,其他3个(N88、N146和N235)在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。

关键词：猪流感病毒类禽型 H1N1 进化分析分子特征

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