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吉林农业大学学报 2014年第6期36卷 701-706页

作者：陶荣珊李金伟刘思国王全凯吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 吉林省中韩动物科学研究院长春130600 吉林东丰药业股份有限公司东丰136300 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室哈尔滨150001

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性，以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，对 Rv1400c 基因进行扩增，并将其克隆到 pET28b （＋）原核表达载体上，构建pET28b－Rv1400c重组质粒，然后将构建的重组... 详细信息

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性，以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，对 Rv1400c 基因进行扩增，并将其克隆到 pET28b （＋）原核表达载体上，构建pET28b－Rv1400c重组质粒，然后将构建的重组质粒转化到BL21（ DE3）表达菌株中，增菌后用IPTG进行诱导表达再用亲和层吸树脂法进行纯化，利用不同底物、不同pH、不同温度对纯化后的Rv1400c酯酶进行活性分析。结果表明：成功构建出pET28b－Rv1400c重组质粒；SDS－PAGE和Western blot显示，Rv1400c以包涵体形式表达，蛋白分子质量为39 ku；在对8种底物的筛选中发现Rv1400c在C2～C14中具有活性，其中以在C2中活性最好；在以C12为底物、pH 8？0、37℃条件下酯酶活性最高。

关键词：结核分枝杆菌酯酶Rv1400c pET28b-Rv1400c重组质粒包涵体酯酶活性

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副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 576-579页

作者：刘双红李大鹏徐胜奎谢芳李刚李婷孙斌王春来黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040

为建立一种快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的血清学方法,本实验采用重组表达的HPS细胞致死膨胀毒素B亚基蛋白(r Cdt B)作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测HPS血清抗体的间接ELISA方法。以该方法检测HPS阳性血清和其他猪病病原... 详细信息

为建立一种快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的血清学方法,本实验采用重组表达的HPS细胞致死膨胀毒素B亚基蛋白(r Cdt B)作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测HPS血清抗体的间接ELISA方法。以该方法检测HPS阳性血清和其他猪病病原阳性血清,除了HPS阳性血清呈阳性外,其余均为阴性,表明该方法特异性良好。批内重复和批间重复的最大变异系数分别小于7%和8%。此外,将Cdt B-ELISA方法与商品化试剂盒Bio Chek HPS-Opp A间接ELISA抗体检测方法对背景明确的116份HPS阳性血清和112份HPS阴性血清进行检测,商品化试剂盒阳性符合率为25%,阴性血清符合率为100%,总符合率为62%,其中Cdt B-ELISA方法对阳性血清的检出率高于商品化试剂盒。应用Cdt B-ELISA方法检测330份临床猪血清样品,结果显示,HPS抗体阳性检出率为11.8%。该方法可以用于HPS的临床检测,为HPS流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。

关键词：副猪嗜血杆菌 rCdtB 间接ELISA

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胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 225-231页

作者：赵济钰王璐孙婧王春来李刚刘思国东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm ... 详细信息

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 MnmE基因基因突变株

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牛支原体表面一种新的膜蛋白(P33)的特性研究

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 255-258页

作者：邹晓辉李媛汪洋宋志强孙文静周玉梅白帆吴金迪刘素丽辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

牛支原体(***)是牛支原体肺炎的病原体,能够引起犊牛肺炎等多种疾病。研究表明,牛支原体粘附蛋白可能在牛支原体致病过程中起关键作用。本研究选取了牛支原体的一个假定膜蛋白,对其基因进行PCR扩增,并连接到pET-28a载体,转化于大肠杆菌B... 详细信息

牛支原体(***)是牛支原体肺炎的病原体,能够引起犊牛肺炎等多种疾病。研究表明,牛支原体粘附蛋白可能在牛支原体致病过程中起关键作用。本研究选取了牛支原体的一个假定膜蛋白,对其基因进行PCR扩增,并连接到pET-28a载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,该重组蛋白大小约为36 ku,将其命名为P33。纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。重组蛋白与胎牛肺细胞(EBL)作用,通过激光共聚焦显微镜观察到了明显的粘附作用,而ELISA试验证明该蛋白的这种粘附为特异性粘附,从而证明该蛋白是牛支原体的一个粘附相关蛋白。

关键词：牛支原体原核表达 ELISA

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大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2016年第1期38卷 6-10页

作者：周薇刘松艳王曼宇衣菲田秋丰陈志宝刘思国于申业黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D... 详细信息

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D缺失株,命名为BL21Δsly D;并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明,缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著,然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株(p<0.01),表明大肠杆菌PPIases sly D基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌sly D基因缺失株BL21Δsly D为进一步研究大肠杆菌sly D基因的功能奠定了基础。

关键词：大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶生物学特性环境压力

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利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赫明雷常月红中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究。首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附... 详细信息

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究。首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附过程后OD405分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078,表明混合血清得到了很好的吸附。同时,将APP1基因组DNA以Bsp1431进行酶切,回收500bp-2000bp的片段,与经过Bam HI酶切的pET30a/b/c进行连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量为2.0×10～5CFU,用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交来筛选该基因组表达文库,筛选了3000个菌落初步获得16个阳性克隆,通过再次筛选最后确定获得12个阳性克隆。本研究为抗病原菌药物、疫苗乃至新的诊断试剂的开发提供依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原技术菌落原位免疫杂交

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用胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库免疫小鼠产生的免疫保护作用

用胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库免疫小鼠产生的免疫保护作用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：刘慧芳周媛媛刘思国宫强王勇刘建东王春来云孟克常月红迟磊赵昆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室

为了筛选、鉴定APP保护性抗原基因库,本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组表达文库(～106个克隆),并将该文库分成10个克隆库(1.0×105个克隆/库)。提取每个克隆库的重组质粒免疫小鼠并以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒,有4... 详细信息

为了筛选、鉴定APP保护性抗原基因库,本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组表达文库(～106个克隆),并将该文库分成10个克隆库(1.0×105个克隆/库)。提取每个克隆库的重组质粒免疫小鼠并以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒,有4个克隆库免疫组(L2,L3,L6,L7)的小鼠在攻毒后的存活率高于其他免疫组和对照组小鼠,肺脏荷菌数显著低于空载体免疫组小鼠。将其中的一个对小鼠具有保护作用的克隆库(L3)进一步分成4个亚克隆库,每个含有～2×104个克隆。结果有一个亚克隆库(L3-4)免疫后的小鼠能基本抵抗1型胸膜肺炎的感染,肺脏荷菌数最低,并能诱导小鼠产生特异性的免疫应答。结果表明,本研究构建的基因组表达文库含有一部分基因,该基因表达的蛋白能使免疫小鼠抵抗APP的感染。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库免疫保护

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牛分枝杆菌细胞壁相关蛋白表达及免疫原性分析

牛分枝杆菌细胞壁相关蛋白表达及免疫原性分析

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：亓英芳杜艳芬刘慧芳赫明雷司微倪洪波王春来刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的严重危害奶牛业的人畜共患病,可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人,对人类的健康也造成了威胁.传统的BCG苗保护力低,因此研究更加特异准确的结核病新型诊断方法并加快新型疫苗的研... 详细信息

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的严重危害奶牛业的人畜共患病,可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人,对人类的健康也造成了威胁.传统的BCG苗保护力低,因此研究更加特异准确的结核病新型诊断方法并加快新型疫苗的研制具有重要的实际意义与应用前景.外膜蛋白具有良好免疫原性,可加快巨噬细胞对抗原的递呈作用,激活淋巴细胞增殖反应,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,从而抵抗同源菌和异源菌的攻击,而ompA是编码外膜蛋白抗原的重要基因之一.本实验应用PCR方法扩增出牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA(1041bp),采用DNA重组技术,将这个基因片段连接表达载体pGEX6p-1,并在大肠杆菌中诱导表达外膜蛋白ompA,用glutathioneSepharose 4B纯化蛋白.Western blot分析了两个重组蛋白的免疫学活性.结果本实验构建的重组质粒pGEX6p-1-ompA在大肠杆菌中得到高效表达,western-blot分析表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为结核分枝杆菌的准确诊断以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。

关键词：牛分枝杆菌 ompA 原核表达纯化 Western-blot 免疫原性

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抗牛γ-干扰素特异性单克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2010年第1期 101-102页

作者：林靖凯赵海玲杜艳芬王春来刘慧芳司微王聃刘思国李广兴广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物科学学院黑龙江哈尔滨150030

为了制备抗牛γ-干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究,试验用重组牛IFN-γ蛋白免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA方法进行试验.结果表明:共获得5株抗IFN-γ的单克隆抗体,Ig亚类鉴定均为IgGI,... 详细信息

为了制备抗牛γ-干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究,试验用重组牛IFN-γ蛋白免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA方法进行试验.结果表明:共获得5株抗IFN-γ的单克隆抗体,Ig亚类鉴定均为IgGI,轻链为k链;经Weatern-blot试验证实5株McAb均能与IFN-γ发生特异性反应,而与其他蛋白不发生反应,特异性好;以5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水,效价均达到1:50 000以上.

关键词：牛γ-干扰素蛋白免疫单克隆抗体

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禽致病性大肠杆菌生物被膜的形成及其影响因素

禽致病性大肠杆菌生物被膜的形成及其影响因素

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第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：欧阳凤菊刘慧芳司微王春来赫明雷倪洪波刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室

摘要为了确定影响细菌生物被膜(BF)的形成条件,本研究采用BF体外定性观察和定量粘附性检测两种方法 ,对一株野生禽致病性大肠杆菌(***)在不同条件(培养时间、培养基类型、引导载体类型、营养条件)下产生BF的差异进行了研究。结果显示,... 详细信息

摘要为了确定影响细菌生物被膜(BF)的形成条件,本研究采用BF体外定性观察和定量粘附性检测两种方法 ,对一株野生禽致病性大肠杆菌(***)在不同条件(培养时间、培养基类型、引导载体类型、营养条件)下产生BF的差异进行了研究。结果显示,野生禽致病性***在宿主体外BF最适形成条件是:培养时间为48 h,培养基为5%TSB、引导载体为平底96孔聚苯乙烯微孔板(美国Corning Costar)。其生长周期为8 h时开始起始粘附、24 h形成若干微菌落、36 h微菌落粘连、48 h形成完整的BF、72 h细菌脱落开始下一轮的BF生长。糖分和适量的无机盐都可以在一定程度上促进BF的形成和被膜内细菌的粘附性提高。该研究明确了禽致病性*** BF的形成条件和周期,为抑制其形成提供了实验依据。

关键词：禽致病性大肠杆菌生物被膜细菌粘附性

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