检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 688-691页

作者：田秋丰于申业衣菲倪宏波吕雪莲刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到p... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到pET-28a和pUC19载体中,构建重组质粒pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况。结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体菌中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达。本研究构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型原核细胞表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 prfA基因温控表达荧光蛋白

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放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

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中国兽医科学 2010年第6期40卷 561-564页

作者：倪宏波刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮王聃赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列... 详细信息

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果表明,成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。表明pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性作用

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抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物*学特性鉴定

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第11期36卷 35-39,46页

作者：赵磊魏建忠周国辉于永忠李万于力安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

【目的】针对O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus,FMDV)制备特异性的单克隆抗体,为进一步研制O型口蹄疫诊断方法提供物质基础。【方法】用纯化的O型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,结合间接ELIS... 详细信息

【目的】针对O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus,FMDV)制备特异性的单克隆抗体,为进一步研制O型口蹄疫诊断方法提供物质基础。【方法】用纯化的O型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,结合间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,建立稳定的阳性杂交瘤细胞株,并对制备的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。【结果】获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B9和5F7,抗体亚类鉴定其均为IgG1/κ类型;IFA结果显示,2株单克隆抗体仅与O型FMDV反应,不与Asia1型FMDV反应,推测其均为抗O型FMDV的型特异性单克隆抗体;Western blot结果显示,2株单克隆抗体均无特异性条带出现,表明其所针对的抗原表位均为构象型表位;相加ELISA试验表明,2B9与5F7两株单克隆抗体识别的抗原表位相近或相同;经硫氰酸盐洗脱法测定,2B9和5F7的相对亲和力指数均为1.5 mol/L;中和试验显示,2株单克隆抗体都不具有中和活性。【结论】2株单克隆抗体的获得及其生物学性质的鉴定,为O型口蹄疫诊断方法的建立提供了基础材料。

关键词： O型口蹄疫病毒单克隆抗体生物学特性鉴定

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牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat6融合基因的分子克隆及表达

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中国预防兽医学报 2007年第8期29卷 588-590页

作者：迟磊刘思国王春来宫强赵昆王勇刘建东云孟克赵福广中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学生物技术学院吉林长春130118

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a(+)中获得重组质粒pET64-85... 详细信息

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a(+)中获得重组质粒pET64-85b-e6。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)进行诱导,SDS-PAGE电泳分析表达情况,以Ni^(21)亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western blot分析融合蛋白的免疫活性。结果表明:表达的融合蛋白大约为76 Ku,与预测大小相符,以Ni^(21)亲和层析柱纯化的融合蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应。

关键词：牛分枝杆菌融合基因重组表达

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国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 661-664页

作者：辛九庆李媛郭丹宋念华胡守萍陈超裴洁曹培丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 湖北省动物疫病预防控制中心湖北武汉430064

牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一。本研究利用选择性培养基从2份患肺炎的犊牛肺脏病料中得到2株支原体,分别命名为Hubei-1和Hubei-2,并在固体培养基进行了3次克隆纯化。通过生化实验、特异... 详细信息

牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一。本研究利用选择性培养基从2份患肺炎的犊牛肺脏病料中得到2株支原体,分别命名为Hubei-1和Hubei-2,并在固体培养基进行了3次克隆纯化。通过生化实验、特异性PCR鉴定和序列比较证明为牛支原体。其16SrRNA核酸序列与牛支原体国际标准株PG45同源性为99.3%。以该培养物作为包被抗原的ELISA检测方法对13份发病犊牛血清进行了检测,其中11份血清抗体OD值为阴性血清对照值的2倍以上。该结果首次证实,国内部分地区存在牛支原体的流行。

关键词：牛支原体分离鉴定

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猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备

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中国预防兽医学报 2009年第7期31卷 572-576页

作者：曹培丽李媛陈超郭丹辛九庆李继昌东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从MhpJ株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和westernblot检测重组蛋白表达及其免疫学活性。以该重组蛋白为抗原免疫兔制备... 详细信息

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从MhpJ株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和westernblot检测重组蛋白表达及其免疫学活性。以该重组蛋白为抗原免疫兔制备抗血清,采用间接ELISA检测抗血清效价,并利用抗血清通过间接免疫荧光检测P52基因在AD-293细胞中的表达情况。结果表明,PCR扩增目的基因为1202bp,SDS-PAGE检测重组蛋白大小约52ku,其表达量占菌体总蛋白的28%。Westernblot检测表明,目的蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫活性。间接免疫荧光检测到P52基因在AD-293细胞中表达。本研究为构建P52蛋白腺病毒载体疫苗奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体 P52蛋白原核表达抗血清

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广东屠猪肉样品中大肠杆菌耐药性与毒力特征的分析

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中国预防兽医学报 2011年第1期33卷 32-36页

作者：孙迎廖晓萍王秀梅孙坚刘宝涛朱恒乾张悦王杨张美君刘雅红华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为分析广东地区屠猪肉中大肠杆菌(***)药物敏感菌株的血清型、毒力基因和系统进化背景,本研究从屠猪肉样品中分离出112株***,采用玻片凝集法鉴定血清型,琼脂稀释法测定10种抗菌药的敏感性,PCR方法检测7种毒力相关基因,多重PCR方法进行... 详细信息

为分析广东地区屠猪肉中大肠杆菌(***)药物敏感菌株的血清型、毒力基因和系统进化背景,本研究从屠猪肉样品中分离出112株***,采用玻片凝集法鉴定血清型,琼脂稀释法测定10种抗菌药的敏感性,PCR方法检测7种毒力相关基因,多重PCR方法进行系统进化背景判定。结果显示,112株***中,定型菌株95株,分别属于15种血清型,其中O65、O131、O8和O158为优势血清型。几乎所有菌株对氟苯尼考、多西环素和四环素高度耐药,而对头孢曲松高度敏感,其中多重耐药菌株多数耐5种以上药物,常见的多重耐药表型是氟苯尼考/氯霉素/多西环素/四环素/氨苄西林。PCR鉴定结果表明,含有毒力基因的菌株中38%至少具有两个毒力基因,其中EAST1+Stx2e和hlyF+Stx2e比较常见。比较常见的毒力基因为Stx2e和EAST1,STb基因仅在一株菌中检测到。多重PCR鉴定结果显示,屠猪肉样品中***主要分布为共生型的A组和B1组。本研究为大肠杆菌病的控制和合理使用抗生素提供实验依据。

关键词：大肠杆菌耐药性血清型毒力基因

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结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2015年第2期45卷 172-176页

作者：崔莹莹宋宁宁党光辉曹俊李华芳于申业刘思国吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋... 详细信息

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv3295基因原核表达单克隆抗体

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马传染性贫血病毒疫苗株S2基因不同变异位点逆向突变感染性克隆的体外复制特性分析

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中国预防兽医学报 2009年第12期31卷 919-924页

作者：高旭姜成刚高华林跃智赵立平相文华周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室黑龙江哈尔滨15000 延边大学农学院动物医学系吉林延吉133002

为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAVFDDV15)S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDV15感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向... 详细信息

为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAVFDDV15)S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDV15感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向突变为强毒株相应氨基酸的6株感染性克隆衍生毒株。经实时定量PCR、逆转录酶活性和western blot等检测表明,疫苗株S2基因4个稳定性变异位点全部逆向突变的感染性克隆衍生毒vpFDDVS2r1-3-4-5在体外培养靶细胞中的复制水平低于亲本疫苗株感染性克隆衍生病毒和其他组合的逆向突变的感染性克隆衍生病毒,提示EIAV疫苗株S2蛋白4个稳定突变位点的综合作用可能是决定疫苗株和强毒株特性差异的因素之一。以上结果为体内感染S2基因逆向突变感染性克隆衍生病毒,进一步揭示S2基因在EIAV弱毒疫苗致弱过程中的作用提供了依据。

关键词：马传染性贫血病毒 S2基因逆向突变感染性克隆复制特性

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胎儿弯杆菌病TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2009年第11期31卷 874-877页

作者：赵海玲刘慧芳杜艳芬司微王春来刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

为建立胎儿弯杆菌(***)定量检测方法,本研究根据***毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测***的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究,结果显... 详细信息

为建立胎儿弯杆菌(***)定量检测方法,本研究根据***毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测***的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究,结果显示,该方法检测***结果均为阳性,而非***均为阴性;对带有SapA基因的阳性质粒的检测敏感性为108拷贝～102拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可敏感地检测到模板中13个拷贝的细菌DNA,其灵敏度是常规PCR方法的100倍。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。该方法为***快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。

关键词： C.fetus 表面蛋白基因SapA 实时荧光PCR TaqMan水解探针

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