检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2008年第10期24卷 1734-1739页

作者：孙元祁巧芬梁冰冰成丹李娜于墨洋王宇飞刘霓虹朱庆虎仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱... 详细信息

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA。结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010 TCID50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 w抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上。由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗。

关键词：猪瘟病毒 E2基因重组腺病毒免疫原性家兔

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牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用

引用

中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 537-543页

作者：祖立闯朱远茂王延辉辛九庆李娇任宪刚冯军科薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒... 详细信息

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒悬液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显影响。在重复性试验中,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与中和试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为84.1%、85.0%和83.4%。应用该诊断方法和本实验室已建立的以IBRV全病毒作为包被抗原的ELISA诊断方法,同时检测了采集于国内11个省份的2012份血清样本,IBRVgD-ELISA检测的平均阳性率为46.0%(926/2012),而且相对于IBRV全病毒ELISA诊断方法的符合率、敏感性和特异性分别为91.9%、94.2%和90.2%。本研究所建立的IBRVgD-ELISA具有良好的敏感性和特异性,为国内IBR流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：牛传染性鼻气管炎重组gD蛋白间接ELISA

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鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

引用

微生物学报 2008年第12期48卷 1666-1670页

作者：秦立廷祁小乐高玉龙高宏雷步志高王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtAΔVP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtAΔVP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5 感染性克隆重组病毒

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猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析

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病毒学报 2007年第5期23卷 389-393页

作者：彭伍平夏照和侯强李娜孙元童光志仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基... 详细信息

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因置于蜂素信号肽序列下游,使其在Sf9细胞内表达重组Shimen-E2和HCLV-E2蛋白。结果显示,重组E2蛋白以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,但二者分子量存在差异。用endo H和PNGase F对纯化后的重组E2蛋白进行去糖基化处理后,二者分子量大小变成一致,证实石门强毒株和兔化弱毒株E2蛋白分子量大小的差异可能是由于糖基化程度的差异所致。对986N糖基化位点进行定点突变后发现,突变后的Shimen-E2与野生型HCLV-E2分子量大小一致,而突变后的HCLV-E2与野生型Shimen-E2分子量大小一致,表明Shimen-E2和HCLV-E2分子量大小的差异的确是由于986N糖基化位点的差异引起的。

关键词：猪瘟病毒 E2囊膜糖蛋白糖基化位点杆状病毒表达系统蜂素信号肽

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猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

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微生物学报 2011年第5期51卷 643-647页

作者：吕茂杰陈建飞时洪艳陈小金范秀萍申识川冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B2... 详细信息

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核磷蛋白B23.1 共定位

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禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

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微生物学报 2009年第10期49卷 1380-1384页

作者：高立祁小乐高宏雷高玉龙秦立廷孙芬芬张云王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体... 详细信息

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋白表达并鉴定。用纯化的gp90蛋白免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆血清。用间接免疫荧光试验检测该血清的特异性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)滴定其效价。【结果】REV gp90基因在重组大肠杆菌中正确表达,免疫小鼠后获得的抗血清可与重组杆状病毒表达的gp90蛋白特异性反应,ELISA效价达到1∶12800,该研究为开展REV诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90蛋白原核表达纯化多克隆抗体

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牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的截短表达与鉴定

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中国生物工程杂志 2008年第12期28卷 24-29页

作者：冯军科薛飞李娇祖立闯朱远茂任宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室哈尔滨150001

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a... 详细信息

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段均获得了表达,且为可溶性表达。利用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。对建立BRSVG蛋白的血清学诊断方法和为开展BRSVG蛋白生物学功能的研究奠定了基础。

关键词：牛呼吸道合胞体病毒 G基因克隆表达

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传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定

引用

病毒学报 2007年第4期23卷 305-311页

作者：邓小芸高玉龙高宏雷祁小乐王晓艳王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体（HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E）的抗原表位进行了研究。通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109-119aa（位于IB-DV聚合蛋白的864-874aa）,HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177-190aa（位于IBDV聚合蛋白的932-945aa）。进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应。将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性。与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%。通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义。

关键词： IBDV VP3 抗原表位融合表达 Western blot ELISA 单抗

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鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建

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中国农业科学 2007年第10期40卷 2343-2349页

作者：祁小乐高宏雷高玉龙邓小芸步志高王晓燕王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001

【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)拯救平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDVGt株全基因组中引入分子标签(A节段:EcoR V酶切位点;B节段:PstI酶切位点)。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(Ham... 详细信息

【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)拯救平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDVGt株全基因组中引入分子标签(A节段:EcoR V酶切位点;B节段:PstI酶切位点)。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游,构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT,LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞,进行病毒拯救研究。【结果】构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV,且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE,且TCID50与亲本毒差异不显著,具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济,且具有良好的细胞普适性。

关键词：传染性法氏囊病病毒感染性分子克隆病毒拯救分子标签核酶

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马传染性贫血病毒第1 9、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 487-491,518页

作者：全滟平赵立平韩秀娥沈楠吕晓玲沈荣显相文华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒(Fetal donkey dermal virus,FDDV)的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDD... 详细信息

不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒(Fetal donkey dermal virus,FDDV)的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDDV在基因水平上的差异,本实验对无免疫保护效果的第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA进行了全基因序列测定,并与已测序的疫苗毒株进行序列比较。第19代和第26代FDDV全基因核苷酸序列同源性高达99.5%,与疫苗毒株全基因核苷酸序列的同源性分别为96.9%、96.7%。LTR是EIAV在细胞传代中变异最显著的区域,第19、26代FDDV的LTR与疫苗毒的LTR同源性仅为89.6%、89.3%。马传贫病毒的gag基因高度保守,第19、26代FDDV与疫苗毒株的gag基因推导氨基酸序列仅有2个氨基酸不同。第19、26代FDDV与疫苗毒株的pol基因、env基因的推导氨基酸序列的同源性分别为98.9%、98.8%、93.7%、93.6%。由序列比较结果可以推断,第19代、第26代FDDV不具有免疫保护效果的主要原因可能是由于LTR和env基因的变异,导致病毒复制能力下降或免疫原性丧失,不能诱导机体产生良好的免疫反应。

关键词：马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒全基因序列分析

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