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2013年中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十二次学术讨论会

作者：张小莺陈红秀江雪梅仇华吉西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

目的：通过构建猪IFN-γ的噬菌体展示禽源scFv抗体文库,制备高特异性的scFv抗体.方法：1、构建猪IFN-γ的禽源噬菌体展示抗体文库.免疫SPF鸡4次后,提取SPF鸡脾脏mRNA,反转录为cDNA后,以cDNA为模板扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因,... 详细信息

目的：通过构建猪IFN-γ的噬菌体展示禽源scFv抗体文库,制备高特异性的scFv抗体.方法：1、构建猪IFN-γ的禽源噬菌体展示抗体文库.免疫SPF鸡4次后,提取SPF鸡脾脏mRNA,反转录为cDNA后,以cDNA为模板扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因,并进一步经融合PCR扩增单链抗体(scFv)基因.scFv与pCATAB5E均通过SfiI/NotI酶切后,scFv克隆至pCATAB5E噬菌粒载体,构建噬菌体展示抗体文库,随机挑取的10个克隆;2、抗体基因的大量表达.将随机挑取的10个克隆的抗体基因克隆至原核表达载体pET30a,优化诱导表达条件,并用Ni+柱进行纯化.结果：在噬菌体展示抗体文库中随机挑取的10个克隆,反应性均很高;诱导表达结果显示20℃,0.4mM IPTG,10h为最佳表达条件;可溶性scFv抗体的终浓度为5mg/mL,经ELISA、Western blot和间接免疫荧光检测反应性良好,与鼠源单抗平行比较发现,鸡scFv反应性较鼠源单抗高.结论：本研究构建了猪IFN-γ的噬菌体展示鸡源scFv抗体文库,并制备高特异性的scFv抗体;同时与鼠源单抗进行比较,初步确认了禽源单抗的特殊优势;这些研究结果支持了构建禽源单克隆抗体研发平台的设想,不失为一种有效的抗体研发替代途径.

关键词：禽源单克隆IgY抗体药物开发猪干扰素-γ 噬菌体展示技术

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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在脱氨酶作用下变异的证据

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在脱氨酶作用下变异的证据

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2013国际猪繁殖与呼吸综合征学术研讨会

作者：冷超粮汤艳东董建国侯艳霞常丹蔡雪辉周建华张桂红田志军童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642 华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称"蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种重要传染病.该病在世界范围内广泛存在,给养猪业造成了巨大的经济损失.2006年,我国出现了能导致"非典型蓝耳病"和"高热病&...

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称"蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种重要传染病.该病在世界范围内广泛存在,给养猪业造成了巨大的经济损失.2006年,我国出现了能导致"非典型蓝耳病"和"高热病"的高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),给该病的防控提出了更为严峻的挑战.PRRSV的进化机理,特别是PRRSV由低致病性变异为高致病性的原因,一直是研究的热点领域.在本研究中,我们分别将6对PRRSV弱毒疫苗株与其相应母源强毒株(CH-la/CH-1R、HuN4/HuN4-F112、JXAl/JXAl-R、VR-2332/respPRRS MLV和JA 142/Ingelvac ATP)的全基因组序列进行了比对.有趣的是,这6株PRRSV母源强毒株在Marc-145细胞连续传代过程中都有倾向性的高突变.

关键词：

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猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：蔺文成胡峰任梅崔玉东钱爱东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院吉林农业大学

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种繁殖障碍疾病,与猪渗出性皮炎、断奶仔猪多系统衰弱综合征等疾病有关,对妊娠母猪与仔猪具有极大的威胁,常给养殖业造成巨大经济损失。

关键词：猪细小病毒病 PPV 混合感染新生仔猪生物技术学间接免疫荧光技术防治策略猪瘟病毒弱毒苗流行状况

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果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：邵昱昊韩宗玺陈露菲孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江省疾病预防控制中心

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣... 详细信息

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,具有呼肠孤病毒的形态特征,将病毒命名为Masked Palm Civet/China/2004(MPC/04)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞,这与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的红细胞凝集谱相符。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒未丧失感染能力;1mol/LMgCl2能提高病毒对热的抵抗力。为了进一步从分子水平上证实该病毒是呼肠孤病毒,用哺乳动物呼肠孤病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST比较,选取同源性较高者进行序列同源性分析,发现该片段与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型参考毒株核苷酸同源性最高。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。

关键词：果子狸呼肠孤病毒分离鉴定

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猪捷申病毒8型rVP1-ELISA方法的建立及初步应用

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA方法的建立及初步应用

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：胡峰刘朝霞胡泉博崔尚金刘杉杉赵亚荣吕超超王贵华蔺文成王晓玲张超范王朝中国农业科学院哈尔滨兽医研究所善医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔演 150001 大北农动物医学中心北京 100097

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体检测方法，根据PTV-8 Jilin，2003的VP1基因组设计一对引物，利用RT-PCR扩增VPI基因,然后克隆至原核表达载体pET-30a中，获得重组质粒pET-VP1．并利用大肠杆菌Rosetta高效表达VP1蛋白。经鉴定表达的重组蛋白... 详细信息

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体检测方法，根据PTV-8 Jilin，2003的VP1基因组设计一对引物，利用RT-PCR扩增VPI基因,然后克隆至原核表达载体pET-30a中，获得重组质粒pET-VP1．并利用大肠杆菌Rosetta高效表达VP1蛋白。经鉴定表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子量为36.2 ku，免疫印迹实验表明获得的重组蛋白具有良好的反应原性。应用***亲和层析柱纯化重组蛋白后作为ELISA诊断包被抗原，建立间接ELISA方法。经反应条件优化确定最佳抗原包被浓度为1μg/mL;待检血清最佳稀释倍数为1：100．其作用时间为60min;酶标二抗最佳稀释倍数为1：5000．其作用时间为30min;封闭液为8％的脱脂乳;显色时间为10min;阴阳性临界值为0.3。利用建立的方法对临床样品进行检测并与IFA作比对试验，结果表明该方法特异、敏感、重复性较好，适于PTV抗体检测。这为PTV抗体检测和流行病学调查提供了一种简便、快速的血清学检测方法。

关键词：猪捷申病毒抗体检测基因表达蛋白包被抗原间接ELISA法

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牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法的建立

牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：王伟符芳陈欣李雪松郎越坤田华彬张兴娟李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨师范大学生命科学与技术学院东北农业大学

为建立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列,设计3对特异性多重引物,建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SY... 详细信息

为建立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列,设计3对特异性多重引物,建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SYBR Green-I实时荧光PCR方法。敏感性试验结果表明,本方法能检测到3种病毒的最低病毒含量均为100拷贝/μL;特异性实验结果表明,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、乙型脑炎病毒(JEV),均呈阴性;通过批内及批间的重复试验,其变异系数<1%。该方法具有很强的特异性、很高的灵敏度、很好的重复性。

关键词： SYBR Green-I实时荧光PCR 牛病毒性腹泻病毒-1型猪瘟病毒野毒株猪瘟兔化弱毒疫苗株

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雪龙黑牛卵巢存放不同温度及不同时间对卵母细胞成熟及囊胚发育的影响

雪龙黑牛卵巢存放不同温度及不同时间对卵母细胞成熟及囊胚发育的...

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第四届中国牛业发展大会

作者：许红喜邢雪森吴蒙王秀利李曦大连雪龙产业集团股份有限公司大连水产学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

将雪龙黑牛卵巢分别于38.5℃、32℃、4℃3个不同温度放置4h、8h、12h、24h、48h不同时间间隔的卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚发育率。结果显示,放置于不同温度下(38.5℃、32℃、4℃)4h后,卵裂率依次为74.3%、80.3%、73.5%,囊胚发育率为3... 详细信息

将雪龙黑牛卵巢分别于38.5℃、32℃、4℃3个不同温度放置4h、8h、12h、24h、48h不同时间间隔的卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚发育率。结果显示,放置于不同温度下(38.5℃、32℃、4℃)4h后,卵裂率依次为74.3%、80.3%、73.5%,囊胚发育率为30.8%、34.5%、30%;8h后,观察其卵裂率为50.9%、71.3%、71.2%,囊胚发育率为24.6%、33.7%、23.1%;12h后,其卵裂率为0、4%、69.5%,囊胚发育率为0、4%、20.7%;24h后,仅放置于4℃的卵母细胞仍然可以观察到生长,其卵裂率55.8%,囊胚发育率为20%;48h后,放置于4℃的卵母细胞的卵裂率为20%、囊胚发育率为0.8%。上述观察结果表明,雪龙黑牛卵巢在≤8h的运输途中可以存放于4℃～38.5℃,≥12h的运输时间,则仅能于4℃下存储,若≥48h,雪龙黑牛卵巢卵裂率及囊胚发育率极低,即停止发育。因此,本试验结果提示,雪龙黑牛卵巢的运输应尽量在4℃条件下进行,且运输时间≤48。

关键词：卵母细胞卵丘细胞复合体卵裂率囊胚发育率体外受精技术

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5种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其初步应用

5种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其初步应用

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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：陈微晶符芳蔡雪辉田志军宋淑萍李曦黑龙江省八一农垦大学黑龙江大庆1631109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究将猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、2型猪圆环病毒(PCV-2)5种病毒核酸的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以5种细胞培养毒的核酸作为模板，进行不对称PCR扩增... 详细信息

本研究将猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、2型猪圆环病毒(PCV-2)5种病毒核酸的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以5种细胞培养毒的核酸作为模板，进行不对称PCR扩增，制备靶物，经绿色荧光染料Cy3标记后，分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交。杂交信号经Genepix4000A扫描仪扫描。结果显示，芯片探针可以分别特异地与Cy3标记的5种特异靶物结合。应用本研究制备的基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测，其中，PRRSV阳性样品26份，PCV-2阳性样品47份，且PRRSV、PCV-2混合感染阳性样品17份，PPV阳性样品5份，PRV阳性样品2份，CS-FV检测阳性样品20份。结果表明，本研究设计并点制的cDNA芯片可以特异的检出5种病毒，具有明确的、潜在的诊断应用性。

关键词：猪病病毒病毒感染免疫学检验基因芯片探针

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TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

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检验检疫科学 2009年第5期19卷 17-20页

作者：白兴华原志伟李军民王亚文贺同欣冯力菏泽出入境检验检疫局山东菏泽274000 荣成出入境检验检疫局中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检... 详细信息

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 TaqMan探针荧光定量RT-PCR

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鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李晶梅刘长军张艳萍施维松曲鹏刘爱玲闫福海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室东北农业大学生命科学学院东北农业大学动物医学院

马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒血清1型(MDV1)引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病。MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗"814&q... 详细信息

马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒血清1型(MDV1)引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病。MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗"814"株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡。采用双重实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示,接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1(102.6～105.2copies/106cells);在检测期间,淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势,总体呈现不规律变化,且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加,14d～21d达到峰值,超强毒株峰值处病毒载量可达到107copies/106cells,峰值期病毒载量是感染前期(1d～7d)的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株,即复制能力高于弱毒株。研究表明,MDV1国内流行的毒株有增殖速度快,病毒载量高的新特点;MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低正相关。

关键词：复制动力学马立克氏病病毒血清1型双重荧光定量PCR 分离株病毒载量

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