检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2074-2082页

作者：赵旭阳靳家鑫路闻龙张帅黄丽张改平孙爱军庄国庆河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心郑州450046 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,至今没有研发出安全有效的疫苗,一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中,通过抑... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,至今没有研发出安全有效的疫苗,一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中,通过抑制干扰素和炎症反应,调节凋亡、自噬及细胞免疫等多种途径逃逸机体免疫反应促进自身复制,但具体的机制仍不完全清楚。ASFV复杂的免疫逃逸机制可能是阻碍有效疫苗研发的关键因素之一。借助生物信息学技术对ASFV的基因组和蛋白质组深入分析,筛选病毒的免疫调控关键基因和保护性抗原表位,将在ASFV免疫逃逸分子机制的研究与疫苗研发中发挥重要作用。本文主要对ASFV感染引起的免疫应答反应及可能的免疫逃逸机制研究进行概述,以期为ASF疫苗研制及综合防控提供思路。

关键词：非洲猪瘟非洲猪瘟病毒免疫应答免疫逃逸疫苗研发

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不同马传染性贫血病毒株编码的S2蛋白拮抗SERINC5分子机理的研究

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 1-8页

作者：李荣荣李苏楠 Iqbal Ahmad 郑永辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒... 详细信息

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒相对感染性,分析pSPEIAV19编码的S2蛋白(S2)和中国EIAV弱毒疫苗编码的S2蛋白(HRB-S2)对Ser5抗病毒活性的影响,结果显示S2和HRB-S2蛋白均能拮抗宿主Ser5的抗病毒活性,且S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染293T细胞,检测HRB-S2对Ser5表达的影响,结果显示HRB-S2能显著降解Ser5蛋白,并且HRB-S2降解Ser5的关键氨基酸位点是L^(26)。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染Hela细胞,通过激光共聚焦试验检测HRB-S2对细胞内Ser5定位的影响,结果显示HRB-S2将位于细胞膜表面的Ser5表达下调并内化至细胞浆内,而L^(26)突变后HRB-S2下调Ser5的能力降低。将表达Ser5、HRB-S2、AP-2、Rab7和Rab11的质粒共转染293T细胞,检测AP-2、Rab7和Rab11在HRB-S2降解Ser5中的作用,结果发现三者在HRB-S2降解Ser5中均发挥重要的作用。将与VC或者VN融合表达的Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染Hela细胞,检测三者在细胞内的共定位情况,结果发现HRB-S2存在二聚体,而S2则不会形成二聚体。将表达Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染293T细胞,转染24 h后加入不同降解通路的抑制剂,检测S2降解Ser5的不同通路,结果显示HRB-S2可以通过蛋白酶体通路和溶酶体通路降解Ser5;而S2蛋白只通过溶酶体途径降解Ser5。本研究结果首次表明不同EIAV编码的S2蛋白均能通过降解Ser5蛋白而拮抗其抗病毒活性,其中S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强,HRB-S2蛋白的二聚体化可能会影响其对Ser5的敏感性。本研究阐明了不同EIAV S2蛋白拮抗Ser5的差异及机制,为抗逆转录病毒如HIV-1抗病毒制剂的开发提供参考依据。

关键词：丝氨酸整合因子5 逆转录病毒 S2 HRB-S2 抗病毒活性降解通路

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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 1014-1019页

作者：薛梦迪黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队/黑龙江省兽医免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 详细信息

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。

关键词：病毒吸附模式识别受体病毒复制复制过程病原相关分子模式第一道防线病原微生物流感病毒

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胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 225-231页

作者：赵济钰王璐孙婧王春来李刚刘思国东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm ... 详细信息

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 MnmE基因基因突变株

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杯状病毒疫苗免疫猫中杯状病毒分离株的遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 555-559,571页

作者：郑亚婷刘迪许鑫燕杨育鹏康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为了解猫杯状病毒(FCV)疫苗免疫猫中FCV的感染情况及分子特征,本研究随机采集哈尔滨和大连经灭活疫苗免疫的猫口腔拭子样品29份,从中分离鉴定获得8株FCV,对分离到的病毒进行全基因组测序及同源性与遗传进化分析。全基因组序列同源性分... 详细信息

为了解猫杯状病毒(FCV)疫苗免疫猫中FCV的感染情况及分子特征,本研究随机采集哈尔滨和大连经灭活疫苗免疫的猫口腔拭子样品29份,从中分离鉴定获得8株FCV,对分离到的病毒进行全基因组测序及同源性与遗传进化分析。全基因组序列同源性分析结果显示:8株分离病毒与国内FCV参考株的核苷酸同源性为76.1%~89.3%,与国外FCV参考株的同源性为77.1%~83.5%;8株FCV间的同源性为76.9%~97.9%,DL31株与DL37株的同源性高达97.9%;与疫苗株F4、F9、F65、255相比,8株分离病毒与其同源性在76.2%~79.8%。VP1和全基因组序列遗传进化分析显示:34株FCV可以分为2个大分支,即基因群Ⅰ和Ⅱ,8株分离病毒在两个基因群均有分布,其中分离株HRB46与韩国株12Q087-1处于同一分支,但8株FCV与疫苗株F4、F9、F65、255等均不在一个分支。将分离病毒VP1重要氨基酸位点与传统疫苗株F9比较分析,结果显示:其D区和conE区的氨基酸相对保守,但其5’高变区(5’HVR)与3’HVR的变异较大,而已有研究发现疫苗株F9在E区5’HVR的Asn-GlyThr序列(aa439~aa441)具有较强的免疫原性,8株分离株在该位点发生了1aa~3aa变异;部分B细胞抗原表位中的氨基酸也发生了突变,8株FCV在aa448~aa450这3个位点发生了连续性变异。以上结果表明FCV具有高度的遗传变异性,由此可能造成FCV疫苗免疫失败。本研究首次对FCV疫苗免疫猫开展FCV的分离鉴定,并分析了分离株与疫苗株的差异,为FCV感染的防控和疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猫杯状病毒疫苗全基因组遗传进化

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检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

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中国兽医学报 2022年第1期42卷 53-60页

作者：刘迪郑亚婷许鑫燕董丽丽康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10;拷贝/μL... 详细信息

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10;拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%~0.71%,组间变异系数为0.05%~0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。

关键词：猫杯状病毒实时荧光定量RT-PCR SYBR GreenⅠ ORF1

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副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 331-338页

作者：王建国陈凡若鹿萍臧鑫鑫党光辉姜艳艳崔宁冯婷婷张嘉俊王慧崔莹莹崔子寅刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 辽宁中医药大学辽宁沈阳110847

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶... 详细信息

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。

关键词：副结核分枝杆菌 GDSL脂肪酶 MAP_2739 酶学特性

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SFTSV实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 292-297页

作者：于志亚杨鸣发马云云康洪涛姜骞刘家森李广兴曲连东东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。当质粒标准品浓度为4.22×10^(2)~4.22×10^(9)copies/μL时,荧光定量标准曲线C;值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.9998。该方法对发热伴血小板减少综合征病毒最低检测限为4.22×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍;该方法可特异性地检测出SFTSV,而对同科其他病毒检测结果均为阴性;批内、批间变异系数均小于2%。对采集的200只蜱进行检测,阳性检出率为3.5%,而常规RT-PCR方法的阳性检出率为2%。研究结果表明,本研究建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,为发热伴血小板减少综合征的检测提供了技术手段。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR

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兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

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实验动物科学 2023年第4期40卷 10-16页

作者：张贺陶坤盛陈见兴王豪杰陈洪岩王玉娥夏长友中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队哈尔滨150069

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法... 详细信息

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度,构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMDPm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量;以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性;通过批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。结果最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMDSa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高;该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带,对其他病原体均无扩增条带,表明特异性较强;批间和批内检测结果一致,表明重复性较好;经临床样本检测Pm、Sa和Kp单独的阳性率分别为62.92%、25.84%和49.43%,与已报道的检测方法结果一致。结论本研究成功建立了一种能够同时快速检测兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌多重PCR

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猫疱疹病毒ERA-LFD检测技术的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第1期52卷 11-18页

作者：刘迪许鑫燕郑亚婷杨育鹏康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×... 详细信息

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×10^(1)copies/μL,比普通PCR的检测下限高10倍,与实时荧光定量PCR方法的检测限相当。特异性试验表明,该检测方法与猫细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应。重复性试验表明,组内的变异系数在1.15%~4.76%之间,组间变异系数在2.09%~2.66%之间,均小于5%。对30份临床样品进行检测,该方法的阳性检出数为6,包含用普通PCR方法的检出的5份阳性病料。对临床检测为阳性的ERA扩增产物进行测序,BLAST对比结果证实为FHV毒株。综上所述,建立的ERA-LFD方法可用于猫疱疹病毒的快速检测及流行病学调查。

关键词：猫疱疹病毒 ERA-LFD 快速检测

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