检索结果-内蒙古大学图书馆

伪狂犬病病毒HLJ-2013株gB基因及蛋白特性的初步分析

中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 357-362页

作者：朱冰王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

gB蛋白是介导猪伪狂犬病病毒(PRV)侵入宿主细胞的关键因子之一,同时也是重要的病毒抗原蛋白。为研究PRV分离株HLJ-2013 gB蛋白与其它参考株的差异性,本研究将HLJ-2013株与GenBank中的80条PRV参考株分别进行gB基因序列及推导氨基酸序列... 详细信息

gB蛋白是介导猪伪狂犬病病毒(PRV)侵入宿主细胞的关键因子之一,同时也是重要的病毒抗原蛋白。为研究PRV分离株HLJ-2013 gB蛋白与其它参考株的差异性,本研究将HLJ-2013株与GenBank中的80条PRV参考株分别进行gB基因序列及推导氨基酸序列的比对,并分析其与参考株gB氨基酸位点的差异;基于最大似然法构建了该基因及推导的氨基酸序列的系统发育树;利用间接免疫荧光试验初步比较了HLJ-2013株与PRV SC株gB抗原性的差异。结果显示,基于gB核苷酸序列及氨基酸序列构建的进化树显示HLJ-2013株处于一个独立于我国分离株的单独分支上,表明其起源可能同国内病毒株不同;与参考株相比,其氨基酸序列中存在27个氨基酸差异位点,并有一个独特的插入基序S75P76G77;免疫荧光鉴定结果显示,PRV SC株gB的一株单克隆抗体不与HLJ-2013株病毒发生特异性结合反应,提示两株病毒gB蛋白的抗原性可能存在差异。本研究初步表明HLJ-2013株的gB和其它病毒株的gB存在遗传及生物学特性上的明显差异,提示HLJ-2013类病毒的流行可能会给我国猪伪狂犬病的防控带来潜在威胁。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gB蛋白氨基酸差异免疫荧光

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马泰勒虫和弩巴贝斯虫双重荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1282-1286,1292页

作者：陈克伟胡哲郭奎刘荻萩戚亭郭巍杨光璞杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(***)和泰勒虫属的马泰勒虫(***)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中***和*** 18S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体... 详细信息

马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(***)和泰勒虫属的马泰勒虫(***)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中***和*** 18S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了能够同时检测***和***的双重荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1),马疱疹病毒Ⅳ型(EHV-4),马流产沙门氏菌(*** equi),马链球菌(***),马传染性贫血病毒(EIAV)均无交叉反应,特异性强。敏感性试验结果显示,该方法对***和***的质粒标准品的检测下限均为100拷贝/μL,敏感性高;将***和***的质粒标准品10倍倍比稀释为1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(4)拷贝/μL共5个稀释度,进行组内、组间重复性试验,结果显示该方法的组内、组间变异系数均小于5%,重复性好。利用本实验建立的方法对2019年我国北方西部地区200份马属动物全血样品进行检测,结果显示***的阳性率为47%(94/200),***的阳性率为2.5%(5/200),其中***和***混合感染率为1%(2/200),该方法与套式PCR的符合率为97.5%,且该方法具有耗时较短、易操作等特点。本研究首次建立的EP双重荧光定量PCR检测方法对***和***的鉴别检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要的意义。

关键词：马梨形虫马泰勒虫驽巴贝斯虫双重荧光定量PCR

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质谱筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白及其GO分析

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中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 351-356页

作者：倪子欣黄海翔王金良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白,本研究根据H7亚型流感病毒AH1株与H5亚型流感病毒FJ1160株的HA基因序列设计引物,分别PCR扩增两株流感病毒的HA基因,连接至pCAGGS载体,分别构建了H5、H7亚型流感病毒模式病毒株的HA... 详细信息

为了筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白,本研究根据H7亚型流感病毒AH1株与H5亚型流感病毒FJ1160株的HA基因序列设计引物,分别PCR扩增两株流感病毒的HA基因,连接至pCAGGS载体,分别构建了H5、H7亚型流感病毒模式病毒株的HA蛋白真核表达质粒pCAGGS-HA-AH1与pCAGGS-HAFJ1660。将pCAGGS-HA-AH1、pCAGGS-HA-FJ1660分别转染HEK-293T细胞,经培养后提取细胞膜蛋白,利用免疫沉淀(IP)试验筛选与HA蛋白互作的宿主膜蛋白。质谱(shotgun)分析结果显示,有35种宿主膜蛋白同时与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白存在相互作用。进一步进行基因本体论(GO)分析,结果显示这35个候选膜蛋白主要作为细胞膜及细胞器膜的组分与其他蛋白或离子结合,以介导生物调控及代谢等过程。为了验证筛选结果的可靠性,利用qPCR对代表性基因ATPAP2、DYNLL1、RAB7A进行检测,结果显示代表性基因ATPAP2、DYNLL1、RAB7A在293T细胞中均有表达,与预测相符。本研究首次筛选得到与两种亚型流感病毒HA蛋白同时存在相互作用的宿主膜蛋白,为进一步对宿主蛋白与流感病毒HA蛋白相互作用机制的研究提供基础数据。

关键词： HA蛋白膜蛋白蛋白质全谱分析 GO分析

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SS-HPS-APP三联亚单位疫苗对小鼠保护效果的评价

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 978-984页

作者：龚俊栾慧栾天赵谦乔宏李刚刘思国王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为评价猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗(下称三联苗)对小鼠的保护效果,本研究将猪链球菌(SS)保护性抗原EF和猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)保护性抗原OMP、ApxI、ApxII序列分别克隆至pET-28a和pCold-sumo载体,再转... 详细信息

为评价猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗(下称三联苗)对小鼠的保护效果,本研究将猪链球菌(SS)保护性抗原EF和猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)保护性抗原OMP、ApxI、ApxII序列分别克隆至pET-28a和pCold-sumo载体,再转化至*** BL21(DE3)中构建重组菌,经过诱导表达纯化获得重组蛋白r EF、rOMP、rApxI和rApxII。利用本研究室前期构建的pET-28a-sly/BL21、pET-28a-mrp/BL21、pET-28aoppa/BL21、pET-28a-oppa2/BL21、pET-28a-afua/BL21、pET-22b-cdtb/BL216株重组表达菌株,表达纯化SS的rSLY、rMRP和副猪嗜血杆菌(HPS)的r OPPA、rOPPA2、rAfuA、rCdtB。将上述重组蛋白等量混匀,使每一剂疫苗中各蛋白的含量均为20μg,再与ISA 201佐剂乳化制成三联苗。将血清2型SS(SS2)464株和SS9 GZ2株按照不同比例稀释后感染C57小鼠;将血清5型HPS(HPS5)HN10株、HPS13 ZD12株、血清5型APP(APP5)MD株和APP7 S-8株按照不同比例稀释后感染BALB/c小鼠,统计上述6个菌株对小鼠的最小致死剂量(MLD)。将20只C57小鼠和40只BALB/c小鼠均分成2组(每组含10只C57小鼠和20只BALB/c小鼠),间隔14 d分别皮下免疫2次300μL PBS+ISA 201佐剂和三联苗。二免后14 d采集小鼠血清,通过间接ELISA检测各组小鼠的EF、MRP、SLY、OPPA、OPPA2、CdtB、AfuA、OMP、ApxI和ApxII的抗体水平。首免后28 d,将C57小鼠再按照免疫组别平均分为2组,分别以MLD的SS2和SS9攻菌;同理,将BALB/c小鼠再平均分为4组,分别以MLD的HPS5、HPS13、APP5和APP7攻菌。结果显示:SS2和SS9对C57小鼠的MLD均为5×10^(7)cfu/只,HPS5、HPS13、APP5和APP7对BALB/c小鼠的MLD分别为1.5×10^(8)cfu/只、5×10^(7)cfu/只、1.5×10^(8)cfu/只和7.5×10^(8)cfu/只。与免疫前相比,二免后14 d实验组小鼠体内对EF、SLY、MRP、OPPA、OPPA2、CdtB、AfuA、OMP、ApxI和ApxII的抗体水平显著升高(p<0.0001),对照组小鼠体内对10种抗原的抗体水平均无差异;实验组与对照组二免后抗体水平差异显著(p<0.0001)。攻菌实验中,对照组小鼠在观察期内全部死亡,攻菌SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7的实验组小鼠存活率分别为100%(5/5)、80%(4/5)、60%(3/5)、80%(4/5),80%(4/5),100%(5/5),对照组和实验组的存活率有显著差异(p<0.05)。以上结果表明该三联苗对SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7攻击的小鼠能够提供良好的交叉保护性。本研究首次系统研究并证实了该三联苗的免疫保护结果较好,为其进一步研究及应用提供了实验依据。

关键词：猪链球菌病副猪嗜血杆菌病猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗小鼠免疫效力评价

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布鲁氏菌分泌系统及其底物蛋白的研究进展

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 1019-1024页

作者：焉鑫李干武胡森蔡文通步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

布鲁氏菌是革兰氏阴性胞内寄生菌,属于α变形菌门,根瘤菌目,布鲁氏菌科,布鲁氏菌属(Brucella spp.)。布鲁氏菌可以感染人、家畜及野生动物引发布鲁氏菌病,不仅给养殖业带来严重的经济损失,还有引发严重公共卫生问题的风险。

关键词：布鲁氏菌感染过程基因组胞内存活分泌系统宿主蛋白底物蛋白

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鸭坦布苏病毒E蛋白具有独特交叉反应性中和表位的鉴定

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中国兽医学报 2021年第1期41卷 26-32页

作者：林委卫陈雪明李晨曦白小飞刘明张云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位^(227)GSSAGTWQN^(235)。Western blot显示,残基^(231)G或^(233)W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明^(231)G或^(233)W是抗体1G2识别的... 详细信息

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位^(227)GSSAGTWQN^(235)。Western blot显示,残基^(231)G或^(233)W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明^(231)G或^(233)W是抗体1G2识别的关键氨基酸位点。通过免疫荧光分析(IFA)显示,MAb 1G2与JEV、WNV和ZIKV的E蛋白发生交叉反应,表明该表位是黄病毒的交叉反应性表位。蛋白质和病毒模型显示,表位定位于成熟病毒粒子可接近的表面,在E蛋白结构域Ⅱ的hi环中。本研究首次证明,中和抗体1G2靶向交叉反应表位定位在E蛋白结构域Ⅱ的hi环,该表位的鉴定有助于提高对黄病毒血清诊断中存在交叉反应问题的认识和理解。

关键词：黄病毒鸭坦布苏病毒中和抗体交叉反应性交叉表位

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基于SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系研究SYNJ2BP对EIAV复制的影响

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1258-1262,1281页

作者：王欣慧段盈伊陈克伟王雪峰那雷杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为分析突触小泡磷酸酶2结合蛋白(SYNJ2BP)对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究设计了2条靶向SYNJ2BP基因外显子的特异性sgRNA,将sgRNA插入plenti-CRISPRv2GFP载体获得重组质粒pSYNsgRNA1和pSYN-sgRNA2,将这2个重组质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪分选获得单克隆细胞株,测序结果显示SYNJ2BP基因产生插入突变,经western blot确认已敲除SYNJ2BP基因并稳定遗传,表明获得了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系。将EIAV感染性克隆质粒CMV3-8分别转染SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系与野生型细胞,经western blot证实与野生型细胞相比敲除SYNJ2BP抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,灰度值显示囊膜蛋白表达量降低50%。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系,并发现SYNJ2BP基因敲除后抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,本研究为进一步分析SYNJ2BP调节EIAV复制的分子机制提供了参考依据。

关键词： CRISPR/Cas9 马传染性贫血病毒 SYNJ2BP HEK293T

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非洲猪瘟病毒p30蛋白的真核表达纯化及单克隆抗体的制备

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中国预防兽医学报 2021年第10期43卷 1074-1079页

作者：刘靖钟杰陈伟业王晗张经伟步志高华荣虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp... 详细信息

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp30)获得了表达。将表达rp30的细胞再经G418筛选并采用有限稀释法亚克隆后,采用IFA和western blot鉴定。IFA结果显示,经筛选获得的克隆细胞中有绿色荧光;western blot结果显示,克隆细胞在30 ku~38 ku出现3条特异性条带,表明获得了一株表达rp30的细胞ASFV-p30。表达的rp30利用镍柱亲和层析纯化并经western blot鉴定纯化效果后,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,经ELISA和亚克隆筛选MAb。获得的MAb经亚型试剂盒鉴定,并分别经IFA和western blot鉴定该MAb的反应性,采用间接ELISA方法检测MAb的腹水及细胞培养上清液效价,采用western blot检测该MAb与猪源病原ASFV、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的交叉反应性。结果显示,经ELISA和亚克隆筛选获得一株p30蛋白的MAb 13G2。亚型鉴定结果显示,该MAb重链为IgG1,轻链为κ型。IFA和western blot结果显示,该MAb与ASFV-p30细胞表达的p30蛋白有良好的反应原性。ELISA结果显示该MAb的腹水及培养上清效价分别为1.409600、1.1024。交叉反应性结果显示,仅ASFV感染的细胞与该MAb作用后出现特异性条带,而其他病原感染的细胞均无特异性条带,表明MAb 13G2的特异性较强。本研究首次利用哺乳动物细胞表达系统表达了ASFV p30蛋白,制备的蛋白更接近天然p30蛋白分子,以该蛋白制备的MAb用于检测ASFV更加准确,为ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速检测奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白真核表达单克隆抗体

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猫细小病毒适配体的筛选与鉴定

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 826-831页

作者：董丽丽许鑫燕刘迪郑亚婷康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27... 详细信息

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。

关键词：猫细小病毒适配体 SELEX技术

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紫外线抵抗相关基因UVRAG影响狂犬病病毒感染机制的研究

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 812-819页

作者：何倩倩王鑫鑫罗杰温志远王金良步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并... 详细信息

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并绘制病毒的生长曲线。结果显示,与转染对照siControl的细胞相比,干扰UVRAG的表达再感染RABV后不同时间细胞上清中的病毒滴度均显著降低(p<0.01),表明干扰UVRAG的表达后抑制RABV的复制能力;而过表达UVRAG后则不影响RABV的增殖能力。干扰293细胞中UVRAG的表达后分别感染表达RABV G蛋白的重组VSV(rERA-G-VSV)及VSV,6 h后利用q PCR方法检测各细胞中的病毒拷贝数。结果显示,与未干扰的细胞相比,干扰UVRAG表达后细胞中rERA-G-VSV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但干扰或者未干扰细胞中VSV基因拷贝数则无显著差别。表明RABV G蛋白是rERA-G-VSV在干扰UVRAG表达细胞中增殖下降的原因且UVRAG影响RABV感染的早期侵入阶段。干扰293细胞中UVRAG表达后感染rERAmCherry,利用酸绕过试验进一步分析RABV感染的阶段;上述干扰细胞感染rERA-mCherry后不同时间点(0、1.5 h、6 h)利用qPCR方法检测病毒基因拷贝数,分析UVRAG影响RABV侵入的具体阶段。酸绕过试验结果显示,经pH7.5的PBS处理后,干扰组的细胞相对于未干扰组细胞中RABV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但pH5.5的酸性PBS处理后两组转染细胞中的病毒拷贝数无显著差异。进一步证明UVRAG在RABV感染早期的侵入阶段发挥重要作用。不同时间点病毒基因拷贝数的qPCR检测结果显示,病毒感染后0、1.5 h两种转染细胞中的病毒拷贝数均无显著差异,但在感染病毒6 h时干扰组的细胞相比于未干扰组的细胞中病毒的拷贝数显著降低(p<0.01)。表明UVRAG影响病毒的胞内运输阶段。利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测UVRAG及其不同结构域蛋白与RABV受体一代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)的相互作用关系,结果显示UVRAG的N端aa1~aa147与mGluR2存在特异性的相互作用。以上结果表明,UVRAG影响RABV的胞内运输可能与其和mGluR2的互作相关。本研究初步揭示了UVRAG在RABV感染中的作用,为RABV侵入机制的揭示奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒紫外线抵抗相关基因胞内运输代谢型谷氨酸受体2

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