检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2020年第1期42卷 75-79页

作者：范威峰崔鹏飞崔嘉琦谷文丽张元成邢鑫孔兴天彭大新邓国华陈化兰扬州大学江苏扬州225009 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有... 详细信息

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。

关键词：禽流感病毒 H6N6亚型生物学特性

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稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： Cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

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基于Gluc的马源NLRP3炎症小体激活系统的建立

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中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1039-1044页

作者：王岩刘聪那雷王雪峰林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速、敏感的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统,本研究利用PCR扩增马IL-1β(eqIL-1β)、马Caspase-1(eqCaspase-1)、马ASC(eqASC)和马NLRP3(eqNLRP3),构建重组真核表达质粒pCAGGS-eqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA,分别转染HEK 293T细胞,培养24 h后采用western blot方法检测细胞中各蛋白的表达,结果显示各重组质粒均构建正确,且均在HEK 293T细胞中正确表达;通过质粒共转染HEK 293T细胞依次对NLRP3炎症小体复合物中不同组分进行剂量依赖性试验,培养24 h后采用western blot检测细胞中切割的eqIL-1β蛋白,利用荧光素酶底物检测细胞上清中的荧光强度,结果显示NLRP3炎症小体体外激活系统中各质粒的最适转染剂量分别为pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCaspase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng;通过在该系统中加入不同剂量的NLRP3炎症小体激活剂(Nigericin),检测该系统有效性,结果显示细胞中切割的IL-1β蛋白水平以及上清中的荧光强度与Nigericin存在剂量依赖性,表明基于Gluc的马源NLRP3炎症小体体外激活系统正确构建,且其能对马源NLRP3炎症小体激活的相关蛋白和药物进行筛选。本研究建立的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统为马属动物炎症及炎症小体调控方面的研究提供重要的工具。

关键词： NLRP3炎症小体 IL-1β Gluc

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鸭外周血白细胞的单细胞转录图谱研究

鸭外周血白细胞的单细胞转录图谱研究

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：梁雨萌马勇张艳慧陈志杰王志涛李雪峰崔露胥利刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队

鸭是一种重要的经济水禽,也是一些人畜共患病病原(如流感病毒和黄病毒)的天然宿主。然而,目前对鸭的免疫系统及其与病毒的相互作用仍缺乏深入的了解。外周血白细胞是鸭免疫系统抵抗虫媒传染病病原的第一道防线。本研究利用高通量单细胞m... 详细信息

鸭是一种重要的经济水禽,也是一些人畜共患病病原(如流感病毒和黄病毒)的天然宿主。然而,目前对鸭的免疫系统及其与病毒的相互作用仍缺乏深入的了解。外周血白细胞是鸭免疫系统抵抗虫媒传染病病原的第一道防线。本研究利用高通量单细胞mRNA测序(scRNA-seq)在单细胞水平构建了鸭外周血白细胞的转录图谱,将鸭外周血白细胞分为16个亚群,并确定了各亚群的分子标记。此外,与人外周血白细胞单细胞转录图谱的比较分析发现,髓系细胞在外周血白细胞中的聚类存在物种间差异。

关键词：鸭单细胞转录组测序外周血白细胞

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马M2型CD163单克隆抗体的制备及其在巨噬细胞极化类型检测中的应用

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1159-1166页

作者：段盈伊王欣慧陈克伟刘荻萩戚亭郭奎杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬... 详细信息

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬细胞经不同病原感染后的极化表型,本实验截取马巨噬细胞极化标志物CD163基因的SRCR1~SRCR4区域,并分别经原核和真核表达系统表达该重组蛋白CD163。将原核表达的马CD163蛋白免疫小鼠制备CD163的单克隆抗体(MAb),经western blot和激光共聚焦检测该MAb的反应性。以上述实验为基础,采用荧光定量PCR检测不同病原感染巨噬细胞后的3种极化标志物和3种细胞因子基因的转录水平以确定感染后的巨噬细胞的极化表型;将不同病原感染马巨噬细胞24 h后,利用制备的CD163 MAb分别采用流式细胞术检测表达CD163蛋白的马巨噬细胞数量,以及采用western blot检测不同病原感染巨噬细胞后的CD163蛋白的表达量,以进一步鉴定马巨噬细胞的极化状态。荧光定量PCR结果表明,经LPS+IFN-γ诱导后,马巨噬细胞向M1型发生了极化,TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80基因可以作为鉴定M1型马巨噬细胞的标记基因;而经IL-4或者IL-10诱导后,马巨噬细胞向M2型发生了极化,TGF-β、IL-10、CD206、CD163基因可以作为鉴定M2型马巨噬细胞的标记基因。MAb western blot和激光共聚焦结果显示,该MAb与真核表达的CD163蛋白以及经IL-10诱导后马巨噬细胞表达的内源性CD163蛋白均能够很好反应,可以用于马巨噬细胞极化状态的检测。荧光定量PCR结果显示,马流产沙门氏菌(*** equi)、马疱疹病毒(EHV-1)和马动脉炎病毒(EAV)感染马巨噬细胞24 h后,M1型细胞因子TNF-α、IL-1β和其表面标记物CD80基因mRNA的转录水平均显著上调(p<0.05),而EIAV感染24 h后,M2型细胞因子IL-10和其表面标记物CD206、CD163基因的mRNA的转录水平均不同程度的上调。表明*** equi、EHV-1和EAV均能诱导马巨噬细胞极化为M1型,并释放大量促炎性因子,而EIAV则可以诱导巨噬细胞极化为M2型,产生了抑炎因子。利用制备的CD163 MAb经流式细胞术和westen blot鉴定结果均表明,在各病原感染早期,EIAV感染可以诱导马巨噬细胞极化为M2型,而其余3种病原未能诱导马巨噬细胞发生M2型的极化。本研究制备了CD163 MAb并利用其检测了不同病原感染后马巨噬细胞极化的表型,丰富了相关疾病发生机制研究的生物学工具。

关键词：马 M2型巨噬细胞 CD163蛋白单克隆抗体

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猪圆环病毒2型抗独特型纳米抗体的制备及其功能研究

猪圆环病毒2型抗独特型纳米抗体的制备及其功能研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十九次全国学术研讨会

作者：邓盈盈张桂夕王刚王佳茜穆杨蔡雪辉周恩民西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是导致猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)和仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体,是世界养猪业面临的难题[1]。衣壳蛋白(Cap)是PCV2的主要免疫原性蛋白和唯一结构蛋白[2]。抗独特型抗体(AIdorAb2)是以抗体分...

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是导致猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)和仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体,是世界养猪业面临的难题[1]。衣壳蛋白(Cap)是PCV2的主要免疫原性蛋白和唯一结构蛋白[2]。抗独特型抗体(AIdorAb2)是以抗体分子可变区的独特型作为抗原表位诱导产生的特异性抗体[3]。

关键词：

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B型流感病毒NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 779-785页

作者：徐菱张振宇郭兴于萌萌王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏... 详细信息

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 3C3-7经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IBV NP蛋白的双MAb夹心ELISA检测方法。结果显示,该检测方法捕获抗体包被量为每孔100 ng,检测抗体使用量为每孔20 ng,NP蛋白浓度在3.9 ng/mL^62.5 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。利用该ELISA方法对多种病毒进行检测,结果显示该方法仅能与IBV发生反应,表明该方法特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对病毒NP蛋白的最低检测限为13.26 ng/mL,敏感性高;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好;捕获抗体可在25℃和37℃保存4 d,热稳定性好。利用本实验建立的ELISA方法和qPCR方法对本实验室保存的40份人咽拭子进行检测,该方法与qPCR方法相比符合率为70%,表明本研究建立的方法可用于临床检测。本研究建立的ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为B型流感的快速诊断、NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

关键词： B型流感病毒 NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA

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一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 861-866页

作者：钟秋张丹丹宋祖晨孟飞陈艳乔传玲陈化兰曹允考杨焕良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分... 详细信息

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年~2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%~99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以106 EID50 SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log10EID50/mL、4.8 Log10EID50/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。

关键词：猪流感病毒 H1N2亚型序列分析致病性

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猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺组织精细切片中感染特性的研究

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中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 747-752页

作者：崔红亮张洪亮汪孟航贾梅玉孟凡丹蔡雪辉吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪肺脏组织中的感染特性,本研究建立了高度分化的猪呼吸系统体外培养模型-猪肺组织精细切片(PCLS)。该培养体系包含肺脏组织中多种相关细胞并能够体现出肺脏组织的生理结构和生物学功能。本研究... 详细信息

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪肺脏组织中的感染特性,本研究建立了高度分化的猪呼吸系统体外培养模型-猪肺组织精细切片(PCLS)。该培养体系包含肺脏组织中多种相关细胞并能够体现出肺脏组织的生理结构和生物学功能。本研究针对制备的猪PCLS进行生物学活性的鉴定,利用评估支气管上皮细胞纤毛摆动百分比的方法检测支气管上皮细胞纤毛活性,结果显示猪PCLS制备良好,在制备10 d以后仍保持95%以上的纤毛活性;利用活/死细胞染色法测定制备的猪PCLS体外培养后活细胞的比例,结果显示制备的猪PCLS在体外培养7 d后支气管上皮细胞和肺泡细胞仍为活细胞;利用间接免疫荧光试验测定猪PCLS中上皮细胞、杯状细胞和肺泡巨噬细胞(PAM)的完整性与分布情况,结果显示制备的猪PCLS上皮细胞和杯状细胞保存完整且猪PCLS中包含丰富的PAM。利用6株不同PRRSV分离株(HuN4、XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75和DL-1510)以2.5×105TCID50/片的剂量感染猪PCLS,检测不同PRRSV分离株在猪PCLS中的感染特性,结果表明不同PRRSV分离株在该培养体系中表现出不同的增殖能力。本研究表明猪PCLS可用于PRRSV的体外感染试验。本研究为PRRSV的体外研究提供了新的模型与方法,同时也为其它猪呼吸道病原体提供了新的研究平台。

关键词：猪肺组织精细切片猪繁殖与呼吸综合征病毒上皮细胞纤毛活性

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猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2020年第8期48卷 19-27页

作者：唐青海杨海彭永刚杨灿何丽芳王芳宇衡阳师范学院生命科学与环境学院畜禽养殖生物工程技术研究所湖南衡阳421008 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪... 详细信息

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P<0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P<0.01或P<0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P<0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P<0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P<0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P<0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P<0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P<0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P>0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。

关键词：猪Cyclin A 猪CDK2 细胞周期猪细小病毒病毒增殖

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