检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 46-51页

作者：刘红全王柳童光志杨志彪仇华吉孔宪刚智海东李昌文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

采取马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）辽宁野毒株（Ｌ株）感染马的血液，分离白细胞。提取白细胞中的ＤＮＡ，并以此为模板，利用ＰＣＲ技术分四个片段扩增ＥＩＡＶ前病毒ＤＮＡ。将其分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中... 详细信息

采取马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）辽宁野毒株（Ｌ株）感染马的血液，分离白细胞。提取白细胞中的ＤＮＡ，并以此为模板，利用ＰＣＲ技术分四个片段扩增ＥＩＡＶ前病毒ＤＮＡ。将其分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到ＥＩＡＶ　Ｌ株前病毒基因组全序列。

关键词：马传贫辽宁野毒前病毒核苷酸序列

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PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

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中国兽医学报 2000年第5期20卷 434-437页

作者：王云峰仇华吉周彦君张绍杰郭宝清倪健强童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农牧学院国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,... 详细信息

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验。

关键词：猪生殖-呼吸道综合征病毒杆状病毒表达 PRRSU

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伪狂犬病病毒(PrV)糖蛋白gE基因在重组杆状病毒中的表达

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中国预防兽医学报 2000年第3期22卷 213-215页

作者：倪建强张绍杰冉智光仇华吉王柳孟松树王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

应用PCR方法扩增出 1 .8Kb的伪狂犬病毒糖蛋白gE基因 ,克隆到pUC1 1 9中形成重组质粒pRZE。经测序鉴定后再将gE基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1 392中 ,形成重组质粒pVLgE。将pVLgE与杆状病毒线性DNA(BAC_N_BlueDNA)共转染Sf9昆... 详细信息

应用PCR方法扩增出 1 .8Kb的伪狂犬病毒糖蛋白gE基因 ,克隆到pUC1 1 9中形成重组质粒pRZE。经测序鉴定后再将gE基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1 392中 ,形成重组质粒pVLgE。将pVLgE与杆状病毒线性DNA(BAC_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经三轮蚀斑纯化 ,获得重组病毒rpVLgE。通过PCR方法鉴定证明gE基因正确插入到杆状病毒基因组中 ,直接免疫荧光试验和WesternBlot结果表明gE基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得高效表达。表达的gE蛋白将作为伪狂犬病强毒和gE基因缺失弱毒疫苗鉴别诊断ELISA方法的抗原。

关键词：糖蛋白E 猪伪狂犬病 PrV 基因表达杆状病毒

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外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 179-180页

作者：钱平仇华吉童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

甲醇酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶ＡＯＸ１基因启动子的控制下，某些外源基因（如ＴＮＦ、ＥＧＦ等）的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，... 详细信息

甲醇酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶ＡＯＸ１基因启动子的控制下，某些外源基因（如ＴＮＦ、ＥＧＦ等）的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及整合到酵母染色体的位置和方式、ｍＲＮＡ的５’和３’非翻译区（ＵＴＲ）、转录起始密码子的上下文、外源基因Ａ＋Ｔ的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成分和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素都需加以考虑。本文将就这些因素作一概述和讨论，以有利于提高外原基因在该系统中的表达水平。

关键词： Pichia pastoris表达系统表达策略

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马传贫病毒白细胞弱毒疫苗毒株反转录酶基因克隆及序列分析比较

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中国预防兽医学报 2000年第2期22卷 99-101页

作者：张宝山刘永刚卢景良孔宪刚刘胜旺杨威马云燕中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

本实验从商品化马传贫弱毒疫苗培养物提纯马传贫疫苗毒病毒粒子并抽提病毒RNA后 ,采用RT_PCR方法扩增并首次克隆了马传贫驴强毒反转录酶 (RTase)基因。经核苷酸序列测定得出反转录酶基因全长 1 6 6 8bp ,编码 5 5 6个氨基酸。通过与已... 详细信息

本实验从商品化马传贫弱毒疫苗培养物提纯马传贫疫苗毒病毒粒子并抽提病毒RNA后 ,采用RT_PCR方法扩增并首次克隆了马传贫驴强毒反转录酶 (RTase)基因。经核苷酸序列测定得出反转录酶基因全长 1 6 6 8bp ,编码 5 5 6个氨基酸。通过与已发表其它马传贫病毒反转录酶基因序列比较 ,发现在氨基酸和核苷酸水平差异率分别为 1 4 .0 %和 1 6 .6 %。变异氨基酸随机分布于整个基因上 ,无明显规律。在反转录病毒高度保守的酶基因上发现这样大的差异 ,展示出马传贫驴强毒作为马传贫弱毒疫苗亲本毒株的独特分子特性。

关键词：马传贫驴强毒反转录酶基因克隆序列分析 EIAV

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绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 44-45页

作者：孟庆文曹素芳李媛金红于康震中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_... 详细信息

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3，以ＢａｍＨⅠ鉴定方向，以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣＫ，经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆，荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ，并成功转染ＭＤＣＫ，在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。ＧＦＰ基因可在ＭＤＣＫ细胞中成功表达，并发出绿色荧光，是一良好的报告基因和筛选标记。

关键词：绿色荧光蛋白真核表达载体构建表达检测

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通用伪狂犬病病毒转移载体的构建

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 1-5页

作者：仇华吉童光志周彦君李昌文钱平孔令达中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

克隆伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株基因组的ＫｐｎⅠ　Ｊ片段，然后亚克隆其中的ＫｐｎⅠ－ＰｓｔⅠ片段，缺失重组质粒中的ＥｃｏＲⅠ位点和ＮｏｔⅠ－Ｈｉｎｄ Ⅲ片段；再用ＡｃｃⅠ切去３７８ｂｐ，在此缺失位置... 详细信息

克隆伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株基因组的ＫｐｎⅠ　Ｊ片段，然后亚克隆其中的ＫｐｎⅠ－ＰｓｔⅠ片段，缺失重组质粒中的ＥｃｏＲⅠ位点和ＮｏｔⅠ－Ｈｉｎｄ Ⅲ片段；再用ＡｃｃⅠ切去３７８ｂｐ，在此缺失位置插入来源于ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子、多克隆位点和ＢＧＨｐｏｌｙＡ信号，构建了通用ＰＲＶ转移载体ｐＢｄＴＫ－Ｕｎｉ。此转移载体为改造Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。

关键词：伪狂犬病病毒 TK基因转移载体

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RT-PCR快速诊断禽流感

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 176-177页

作者：刘明于康震崔尚金孔宪刚唐秀英徐宜为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果，设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物，不经病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸，ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出３２６ｂｐ的ＮＰ基因片段。采用... 详细信息

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果，设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物，不经病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸，ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出３２６ｂｐ的ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株，４个亚型１２株国内分离野毒株，ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性；对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒，ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２；２４／５５、２４／５５，二者符合率大于９５％。ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，只用６个小时就可得出准确的诊断结果，证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异，可用于禽流感的快速诊断。

关键词：禽流感病毒诊断反转录-聚合酶链式反应

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应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

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中国预防兽医学报 2000年第4期22卷 278-281页

作者：周艳君仇华吉王云峰钱平蔡雪晖柴文君翁长江童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。

关键词：杆状病毒表达系统 GP5基因 PRRS 重组疫苗

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禽轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究

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中国预防兽医学报 2000年第1期22卷 1-2页

作者：崔尚金王云峰邓国华于康震中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

从北京某自然腹泻的鸡场中成功地分离到一株禽轮状病毒,并经鸡胚单层肝细胞和MA104 细胞进行了传代培养,对其生物学特性作了部分研究,从而为我国禽轮状病毒的毒株鉴定。

关键词：禽轮状病毒分离鉴定

来源：评论

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