检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2013年第12期35卷 955-959页

作者：张雅春胡卫杰王建超王伟邓瑞坡李越赵颖慧孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物研究室黑龙江哈尔滨150001

视黄酸诱导基因蛋白1(RIG-1)是一类模式识别受体,在机体抗病毒天然免疫过程中发挥重要作用。为检测金定鸭RIG-1基因的组织特异性表达水平和体外抗禽流感病毒(AIV)活性,本研究采用RT-PCR方法扩增鸭RIG-1基因并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重... 详细信息

视黄酸诱导基因蛋白1(RIG-1)是一类模式识别受体,在机体抗病毒天然免疫过程中发挥重要作用。为检测金定鸭RIG-1基因的组织特异性表达水平和体外抗禽流感病毒(AIV)活性,本研究采用RT-PCR方法扩增鸭RIG-1基因并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重组真核表达质粒pcDNA-RIG-1,应用荧光定量PCR方法检测该基因在鸭不同组织中的特异性表达水平;并将pcDNA-RIG-1转染DF-1细胞,通过病毒TCID50测定、间接免疫荧光、荧光定量PCR的方法检测RIG-1的抗AIV活性。结果显示,从金定鸭脾脏中扩增的RIG-1基因的CDS序列大小为2 802 bp,编码934个氨基酸;RIG-1基因在不同组织中的表达各不相同,在鸭的脾脏和肾脏中表达量较高,肝脏中度表达,心脏、肺脏和肌肉低度表达;pcDNA-RIG-1转染DF-1细胞组与pcDNA3.1(+)转染组相比,病毒TCID50及相对表达量显著降低,IFN-β及Mx的相对表达量显著升高,表明RIG-1产生了显著的抗AIV作用。本研究为禽类RIG-1蛋白功能和家禽的天然免疫研究奠定了基础。

关键词： RIG-1 组织表达抗病毒

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非洲马瘟病毒VP7蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

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中国兽医科学 2013年第3期43卷 256-260页

作者：潘佳亮高利相文华戚亭郭巍东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了建立可特异性地检测血清中非洲马瘟病毒抗体的方法,优化并合成非洲马瘟病毒VP7蛋白基因,将其插入原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,目的蛋白获得了高效表达,且有... 详细信息

为了建立可特异性地检测血清中非洲马瘟病毒抗体的方法,优化并合成非洲马瘟病毒VP7蛋白基因,将其插入原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,目的蛋白获得了高效表达,且有特异的免疫学活性。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释度、封闭液的选择等反应条件进行了优化。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的非洲马瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达100%。表明本研究建立的检测血清中非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。

关键词：非洲马瘟病毒 VP7蛋白间接酶联免疫吸附试验

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SAMHD1蛋白单克隆抗体的制备及SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 242-244页

作者：戈曼吴星亮尹鑫魏萍王晓钧东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

SAMHD1是最近发现的在人髓系细胞中发挥抗艾滋病毒作用的一种天然蛋白。为制备抗人huSAMHD1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的人huSAMHD1重组蛋白为免疫原,经腹腔免疫4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行... 详细信息

SAMHD1是最近发现的在人髓系细胞中发挥抗艾滋病毒作用的一种天然蛋白。为制备抗人huSAMHD1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的人huSAMHD1重组蛋白为免疫原,经腹腔免疫4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA法筛选和4次有限稀释法克隆纯化,获得了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株。Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的MAb与人huSAMHD1的真核表达蛋白呈阳性反应,而与猴、马SAMHD1的真核表达蛋白呈阴性反应,表明其具有很好的特异性,可以用于ELISA、免疫荧光和免疫印迹检测以及对huSAMHD1的进一步研究。

关键词： SAMHD1 单克隆抗体 ELISA 免疫荧光免疫印迹

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抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第2期35卷 146-150页

作者：孙静周国辉王幸李超斯魏萍于力东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间... 详细信息

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1∶12 800和1∶105。硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L。应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104TCID50病毒,与O型、Asia1型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段。

关键词： A型口蹄疫病毒单克隆抗体抗原捕获ELISA

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O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 185-188页

作者：梁特杨德成刘蒙蒙周国辉孙超魏萍于力东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组杆状病毒,本研究将FMDV O/YS/CHA/05株的P12A和3C基因克隆于pFastBac1载体中,构建重组转移质粒pFast-P12A3C,将其转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rBacmid-P12A3C。将该重组杆粒转染Sf9... 详细信息

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组杆状病毒,本研究将FMDV O/YS/CHA/05株的P12A和3C基因克隆于pFastBac1载体中,构建重组转移质粒pFast-P12A3C,将其转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rBacmid-P12A3C。将该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒rBV-P12A3C。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明,获得的重组杆状病毒在Sf9细胞中能够表达O型FMDV衣壳蛋白。Western blot分析显示,FMDV的衣壳蛋白和3C蛋白酶均获得表达,并且3C蛋白酶对结构蛋白进行了正确切割。重组蛋白表达的动力学分析显示,表达的FMDV衣壳蛋白具有良好的反应原性,并且在重组杆状病毒感染Sf9细胞后第4 d蛋白表达量达到最大。该重组杆状病毒的构建,为研究FMDV空衣壳的体外组装以及O型FMDV空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。

关键词： O型口蹄疫病毒衣壳蛋白杆状病毒表达

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兔视黄醇结合蛋白4基因的克隆及原核表达

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动物医学进展 2013年第7期34卷 53-56页

作者：王泽祥孙宏勇郭东春单丽玲原冬伟刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物研究室黑龙江哈尔滨150001

为表达兔视黄醇结合蛋白4(rRBP4),提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增了rRBP4的基因,大小为606bp。将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)获得表达重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21(DE3)Plyss中进行表达,pET-32a-rRBP4以包涵体形式表达,... 详细信息

为表达兔视黄醇结合蛋白4(rRBP4),提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增了rRBP4的基因,大小为606bp。将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)获得表达重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21(DE3)Plyss中进行表达,pET-32a-rRBP4以包涵体形式表达,包涵体经过洗涤、变性后,用镍离子亲和层析柱纯化,并利用尿素梯度透析法复性。SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子质量一致的特异性目的蛋白;Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。

关键词：兔视黄醇结合蛋白4 原核表达肝细胞

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单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

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中国畜牧兽医 2013年第9期40卷 131-135页

作者：尹海畅吕兴锋刘思国王伟王建超孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物研究室黑龙江哈尔滨150001

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究... 详细信息

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以106、107、108、109和1010CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD50;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD50剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD50为109.25CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础。

关键词：单核细胞增生性李斯特菌感染 ICR小鼠模型

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14匹马经典MHC-Ⅰ类分子多态性分析

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 852-854页

作者：刘建东孙留克林跃智那雷王雪峰杜承周建华曲娟娟东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室、大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为分析马经典MHC-I类分子的多态性，本研究从马外周血单个核细胞提取总RNA，并采用RT—PCR方法对14匹马经典MHC-I类分子（包括编码肽结合区的大部分区域、α3区、穿膜区以及胞浆区）进行扩增和序列分析。结果显示，14匹实验马各自具有2... 详细信息

为分析马经典MHC-I类分子的多态性，本研究从马外周血单个核细胞提取总RNA，并采用RT—PCR方法对14匹马经典MHC-I类分子（包括编码肽结合区的大部分区域、α3区、穿膜区以及胞浆区）进行扩增和序列分析。结果显示，14匹实验马各自具有2个～4个MHC-I等位基因，其在不同马匹之间的表达呈现明显的差异性，主要分布在2个分支。尽管如此，各马匹间均表达具有1个或1个以上相同或高度同源的对应经典MHC-I类分子的mRNA。该研究结果为正在开展的针对马传染性贫血病毒减毒疫苗核心蛋白（p26）以及其他免疫原的CTL表位的筛选提供基础数据。

关键词：马主要组织相容性复合物多态性 RT-PCR

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结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国预防兽医学报 2013年第8期35卷 684-686页

作者：曹俊陈利苹刘银冰鄢秋龙刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

为制备结核分枝杆菌(Mtb)rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白... 详细信息

为制备结核分枝杆菌(Mtb)rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白。将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE和westernblot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性。以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv3036c基因原核表达多克隆抗体

来源：评论

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MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

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中国畜牧兽医 2013年第5期40卷 22-25页

作者：崔鹏鹏高宏雷李凯高立高玉龙祁小乐王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5′端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×105 CFU/mL,文库总容量为1.1×106 CFU,平均插入片段长度... 详细信息

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5′端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×105 CFU/mL,文库总容量为1.1×106 CFU,平均插入片段长度为1190bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×105 CFU/mL,文库总容量为1.2×106 CFU,平均插入片段长度为1087bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。

关键词： MDCC-MSB1细胞 cDNA文库鸡传染性贫血酵母双杂交

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