检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2014年第10期36卷 751-754页

作者：郑惠文李志杰张艳萍包珂岩郑永胜刘长军王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病研究室黑龙江哈尔滨150001

最新研究发现,鸡马立克氏病病毒(MDV)基因组编码的miRNAs在肿瘤发生发展中发挥了重要的调控作用。为阐明强弱毒株编码的miRNA差异表达与病毒复制的关系,本研究采用SYBR Green荧光定量PCR方法检测了MDV CVI988疫苗株和MDV GA强毒株编码的... 详细信息

最新研究发现,鸡马立克氏病病毒(MDV)基因组编码的miRNAs在肿瘤发生发展中发挥了重要的调控作用。为阐明强弱毒株编码的miRNA差异表达与病毒复制的关系,本研究采用SYBR Green荧光定量PCR方法检测了MDV CVI988疫苗株和MDV GA强毒株编码的M4-5P、M8-3P和M12-3P 3种miRNAs在肝脏和胸腺中的动态表达特征。结果表明,强弱毒株编码的这3种miRNAs在病毒感染过程中具有明显的差异性,其中GA株编码的miRNAs表达量高于CVI988株,这是由于强弱毒株在体内的复制滴度差异造成的,表明在感染前期miRNAs的表达量与病毒载量有关。该研究为进一步研究miRNAs的功能提供了实验依据。

关键词：鸡马立克氏病病毒 miRNA 荧光定量PCR

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牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2014年第6期44卷 617-623页

作者：董秀梅朱远茂蔡虹王姝吕闯马磊薛飞东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群... 详细信息

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。

关键词：实时荧光定量RT-PCR TaqMan探针牛副流感病毒3型

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结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定

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畜牧与兽医 2014年第10期46卷 1-5页

作者：张娈娈陈利苹曹俊崔保亮李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES... 详细信息

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。

关键词： Rv3802c蛋白 pC3.1-3LHF-Red重组质粒内部核糖体进入位点(IRES) CHO细胞

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结核分枝杆菌rv0199基因在耻垢分枝杆菌中的表达及检测

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中国畜牧兽医 2014年第7期41卷 9-13页

作者：崔保亮陈利苹张娈娈李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重... 详细信息

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗StrepⅡ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测***的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv0199基因 pMV261 pMV262 耻垢分枝杆菌

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马腺苷酸脱氨酶1在马胎儿皮肤细胞中促进马传染性贫血病毒LTR的启动活性

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中国预防兽医学报 2014年第1期36卷 11-14页

作者：付丽华汤艳东那雷王雪峰林跃智杜承周建华曲娟娟东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

腺苷酸脱氨酶(ADAR)1可催化双链RNA的腺嘌呤核苷酸(A)脱氨转化为次黄嘌呤核苷酸(I),该基因参与了很多病毒的复制与进化。在前期研究中对马传染性贫血病毒(EIAV)疫苗株基因组在体外培养细胞传代致弱过程中的变异规律进行了分析,表明与致... 详细信息

腺苷酸脱氨酶(ADAR)1可催化双链RNA的腺嘌呤核苷酸(A)脱氨转化为次黄嘌呤核苷酸(I),该基因参与了很多病毒的复制与进化。在前期研究中对马传染性贫血病毒(EIAV)疫苗株基因组在体外培养细胞传代致弱过程中的变异规律进行了分析,表明与致弱前强毒株相比,EIAV弱毒疫苗株基因组出现高频率的A-I超突变,推测主要由腺苷酸脱氨酶1(ADAR1)催化导致,使基因组突变累积后的EIAV体内复制能力降低而弱化。为初步研究ADAR1在EIAV致弱中的作用,本研究应用PCR技术首次克隆了马ADAR1(eADAR1)的cDNA。经确认该重组蛋白在293T细胞中的正确表达后,将表达eADAR1的质粒与EIAV长末端重复区(LTR)控制的报告基因质粒共同转染马胎皮肤(FED)细胞,检测eADAR1对LTR启动活性的影响。实验数据表明,该ADAR1可以在体外培养的EIAV靶细胞中显著促进LTR启动的荧光素酶表达,显示eADAR1可以通过调控LTR促进EIAV的复制。以上结果提示eADAR1可以明显影响EIAV复制,但其机制较复杂,尚待深入研究。

关键词：马腺苷酸脱氨酶1 马传染性贫血病毒长末端重复区

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鸽β-防御素1基因的克隆及其生物学作用鉴定

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微生物学通报 2014年第4期41卷 636-645页

作者：李妍妍徐杨张婷婷徐倩倩韩宗玺刘胜旺马得莹东北农业大学动物科技学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

【目的】从鸽子组织中克隆鸽子β-防御素1(AvBD1)基因,在大肠杆菌中表达重组鸽子AvBD1蛋白,测定其生物学特性。【方法】应用RT-PCR法从鸽子骨髓组织中扩增鸽子AvBD1基因,采用Real-time PCR法检测该基因在鸽子组织器官中的表达分布。将... 详细信息

【目的】从鸽子组织中克隆鸽子β-防御素1(AvBD1)基因,在大肠杆菌中表达重组鸽子AvBD1蛋白,测定其生物学特性。【方法】应用RT-PCR法从鸽子骨髓组织中扩增鸽子AvBD1基因,采用Real-time PCR法检测该基因在鸽子组织器官中的表达分布。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProEX-HTa的EcoR I和Xho I双酶切位点上,构建重组表达质粒pProEX-pigeon AvBD1,将重组质粒进行诱导表达;对该重组蛋白进行纯化,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸,经序列相似性分析,鸽子AvBD1与鸭AvBD1氨基酸序列相似性最高(81.5%)。鸽子AvBD1主要分布于免疫系统和消化系统组织中。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明,重组鸽子AvBD1蛋白分子量约8.8 kD,与预期大小一致。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性。此外,该重组蛋白的溶血活性极低。【结论】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其主要分布在机体的免疫系统和消化系统中。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低。

关键词：鸽子AvBD1 重组蛋白抗菌活性组织分布

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鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

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中国兽医科学 2014年第2期44卷 165-170页

作者：孙永珍赵妍孔聪聪崔红玉王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道病创新团队黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道病创新团队黑龙江哈尔滨150001

以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)LJS09株基因组为模板,应用PCR方法扩增gG基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建pET-30a-gG-gG串联质粒,转化Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达及纯化,获得His-gG-gG重组蛋白,免疫新西兰大白... 详细信息

以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)LJS09株基因组为模板,应用PCR方法扩增gG基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建pET-30a-gG-gG串联质粒,转化Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达及纯化,获得His-gG-gG重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。用ELISA检测抗体效价为1∶104。Western-blot分析结果表明,制备的家兔抗-ILTV gG抗体能与纯化的gG蛋白发生特异性反应,且能检测到内源性gG蛋白。间接免疫荧光试验结果表明,制备的家兔抗ILTV-LJS09gG蛋白的多克隆抗体分别能与ILTV LJS09、HLJ0507、MDJ0442、SD0203、Zhj1298株反应,特异性良好。

关键词：传染性喉气管炎病毒 gG蛋白原核表达多克隆抗体间接免疫荧光试验

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基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建

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中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 688-691页

作者：田秋丰于申业衣菲倪宏波吕雪莲刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到p... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到pET-28a和pUC19载体中,构建重组质粒pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况。结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体菌中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达。本研究构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型原核细胞表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 prfA基因温控表达荧光蛋白

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通过改进Red重组方法快速构建肠炎沙门菌毒力岛SPI-1缺失株

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中国预防兽医学报 2014年第11期36卷 852-855页

作者：吕雪莲于申业倪宏波衣菲田秋丰刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

沙门菌依赖毒力岛SPI-1编码的Ⅲ型分泌系统在侵染宿主肠道上皮细胞中起重要作用。为制备沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,本研究利用PCR扩增毒力岛SPI-1上下游同源臂和含有氯霉素抗性基因片段,连接p ET-28a构建打靶质粒,采用电击法将其转入含有... 详细信息

沙门菌依赖毒力岛SPI-1编码的Ⅲ型分泌系统在侵染宿主肠道上皮细胞中起重要作用。为制备沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,本研究利用PCR扩增毒力岛SPI-1上下游同源臂和含有氯霉素抗性基因片段,连接p ET-28a构建打靶质粒,采用电击法将其转入含有p KD46a质粒的肠炎沙门菌中。经L-阿拉伯糖诱导同源重组后,鉴定阳性重组子,转化诱导产生重组酶FLp的p CP20质粒,从而删除氯霉素抗性基因,通过PCR方法鉴定缺失株,命名为SM6ΔSPI-1。连续培养鉴定表明缺失株具有良好的遗传稳定性。生长特性研究显示缺失株生长速率高于野生菌株。本研究利用改进的Red重组系统通过一步法构建了肠炎沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,为沙门菌毒力岛的功能研究与基因工程减毒疫苗研制奠定了基础。

关键词：毒力岛SPI-1 Red同源重组缺失株

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雀形目野生鸟类REV感染状况的调查及分离株gp90基因序列分析

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中国兽医学报 2014年第7期34卷 1078-1082,1113页

作者：郝瑞军庄艳娜燕超么帅高宏雷秦立廷高玉龙曾祥伟王笑梅东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了解雀形目野生鸟类感染禽内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的情况,采集了352份样品,应用PCR方法进行了初筛。然后将阳性样品适当处理后接种CEF细胞,利用IFA等方法进一步鉴定。结果分离到2株病毒WB11042和WB110... 详细信息

为了解雀形目野生鸟类感染禽内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的情况,采集了352份样品,应用PCR方法进行了初筛。然后将阳性样品适当处理后接种CEF细胞,利用IFA等方法进一步鉴定。结果分离到2株病毒WB11042和WB11043,分别来自黄喉鹀和燕雀。对2株REV分离株的gp90基因进行扩增、测序和序列分析。结果显示,其gp90序列与REV亚型Ⅲ的代表毒株（CSV、APC-566）亲缘关系最近,高达99%以上;与亚型Ⅱ代表株（SNV）和亚型Ⅰ代表株（HA9901）的亲缘关系相对较远,在95.5%~97.1%之间。遗传进化树分析也表明这2株野生鸟类分离株属于REV亚型Ⅲ。结果表明,雀形目野生鸟类也可以感染REV。

关键词：野生鸟类 REV gp90 序列分析

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