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中国免疫学会第十届全国免疫学学术大会

作者：贾悦李月健喻进张晨亮李娜娜卢晓晓张宁李欣张鼎郝卫芳马海利高文伟赵宇军高诗敏李建慧李桂兰闫芳韩凌霞宁官保田文霞山西农业大学动物科技学院太谷030801 太原市动物疫病预防控制中心太原030024 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学创新团队中心/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

研究背景：红细胞不仅可以运输O2、CO2和调节pH,其自身还拥有一定的免疫功能。红细胞免疫功能方面的研究在哺乳动物及人的无核红细胞中起步较早,发展已比较完善,但在禽类等有核红细胞中起步较晚,发展比较滞后。

关键词：红细胞雏鸡红细胞免疫系统 RNA-Seq 差异表达基因信号通路

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鸡自然杀伤细胞的分离与免疫表型分析

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中国预防兽医学报 2014年第3期36卷 236-238页

作者：杨超张晓娜张园华廉传江文辉强陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801

为研究鸡自然杀伤(NK)细胞,本实验采用冷胰酶消化法消化14日胚龄鸡胚脾脏组织,分离收获鸡胚脾脏淋巴细胞,在含有重组鸡白介素-2和条件培养基的IMDM培养液中培养48 h,收获悬浮细胞,暂时命名为TCR0细胞(即鸡NK细胞)。流式前向角和侧向角... 详细信息

为研究鸡自然杀伤(NK)细胞,本实验采用冷胰酶消化法消化14日胚龄鸡胚脾脏组织,分离收获鸡胚脾脏淋巴细胞,在含有重组鸡白介素-2和条件培养基的IMDM培养液中培养48 h,收获悬浮细胞,暂时命名为TCR0细胞(即鸡NK细胞)。流式前向角和侧向角分析显示培养的TCR0细胞中85.1%的细胞大小均一,颗粒度一致;瑞氏吉姆萨染料染色结果表明TCR0细胞内一侧含有嗜酸性大颗粒,符合鸡NK细胞的形态特征;流式细胞术单克隆抗体染色结果显示,TCR0细胞中,97.4%高表达MHCⅠ类分子,30.8%低表达CD8a,不表达T细胞表面标记CD3和B细胞表面标记CD4和Bu-1,符合鸡NK细胞表面标记特点。本实验是国内成功分离并纯化鸡NK细胞的首次报道。

关键词：鸡自然杀伤细胞分离与培养免疫表型

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猪圆环病毒2型重组病毒分离株的鉴定

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动物医学进展 2014年第6期35卷 26-31页

作者：李海超韩凌霞东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了解某猪场猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行及毒株基因组变异情况，应用 PCR 方法从6个疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）病死猪的心脏、淋巴结、脾脏和肺脏等病料中进行猪圆环2型病毒的检测，并对阳性病料进行 PCV-2全基因组的扩... 详细信息

为了解某猪场猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行及毒株基因组变异情况，应用 PCR 方法从6个疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）病死猪的心脏、淋巴结、脾脏和肺脏等病料中进行猪圆环2型病毒的检测，并对阳性病料进行 PCV-2全基因组的扩增，将成功扩增到的6株 PCV-2全基因组克隆到 pMD-18T Simple Vector，构建重组质粒。对全基因组进行测序，然后对全基因组进行同源性、遗传进化、重组以及毒力分析。结果表明，6株 PCV-2基因组长度均为1767 bp，与参考序列的同源性在88．1％～99．6％之间，并且 LNF3、HEBF5和 HEN65为 PCV-2b1C 基因型，LN51为 PCV-2b1B 基因型，HEN60株为 PCV-2b1A 基因型，HEBF7属于 PCV-2a，但不属于任何亚型，可能为 PCV-2a 向 PCV-2b 的过渡株。利用重组分析软件RDP4．25和 SIMPLOT3．5．1分析，表明 LN51株可能来自 PCV-2a2A 和 PCV-2b1A 基因型的重组。根据PCV-2 Cap 的76位和131位氨基酸残基，有5株符合强毒特征（76I、131T），而 HEBF7株存在强、弱毒的特征。本研究为我国 PCV-2流行株的分子特征研究提供了参考。

关键词：猪圆环病毒2型毒力重组基因型

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MHC单倍型SPF鸭的培育及其TAP基因组序列分析

MHC单倍型SPF鸭的培育及其TAP基因组序列分析

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中国畜牧兽医学会2014年学术年会

作者：张晓娜武永淑吴少莲廉传江文辉强陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室

引言鸭主要组织相容性复合体（MHC）是一组紧密连锁高度多态的基因簇,其单倍型与宿主的抗病性和免疫应答水平密切相关,其中抗原提呈相关转运蛋白（TAP）基因毗邻MHCⅠ基因。HBK鸭排除了10种特定病原体,现已培育至第8代。本研究对获得的... 详细信息

引言鸭主要组织相容性复合体（MHC）是一组紧密连锁高度多态的基因簇,其单倍型与宿主的抗病性和免疫应答水平密切相关,其中抗原提呈相关转运蛋白（TAP）基因毗邻MHCⅠ基因。HBK鸭排除了10种特定病原体,现已培育至第8代。本研究对获得的HBK鸭MHCⅠ区域基因组序列分析,旨在为鸭MHC基因和TAP基因的结构及功能提供了依据。

关键词：基因组序列分析单倍型 TAP MHC SPF

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鸡BLec基因重组蛋白的原核表达及兔多抗制备

鸡BLec基因重组蛋白的原核表达及兔多抗制备

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第十二届中国北方实验动物科技年会

作者：廉传江张园华张晓娜吴少莲文辉强陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

为了制备鸡BLec蛋白的多克隆抗体,本实验采用RT-PCR技术从2月龄B15单倍型鸡的胸腺组织扩增了ChBLec基因,并以pET-30a(+)为原核表达载体成功构建重组质粒pET-30a-ChBLec,并在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG(0.02mmol/L)诱导表达,获得大小约为... 详细信息

为了制备鸡BLec蛋白的多克隆抗体,本实验采用RT-PCR技术从2月龄B15单倍型鸡的胸腺组织扩增了ChBLec基因,并以pET-30a(+)为原核表达载体成功构建重组质粒pET-30a-ChBLec,并在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG(0.02mmol/L)诱导表达,获得大小约为17kDa以包涵体形式存在的ChBLec重组蛋白.把含有重组蛋白的SDS-PAGE胶研磨后制备免疫原,免疫新西兰兔,获得兔抗血清.Western blot检测显示,兔抗血清能检测到pET-30a-ChBLec外源蛋白.结果表明：ChBLec基因在大肠杆菌成功表达,且成功制备了兔抗ChBLec血清,该血清可进一步用于检测ChBLec蛋白在鸡体内的表达情况.

关键词：鸡 ChBLec基因重组蛋白原核表达

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抗流感病毒候选基因的筛选:单链抗体

抗流感病毒候选基因的筛选:单链抗体

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：王伟李越赵颖慧臧凤霞周长良孟庆文陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

本研究用9日龄鸡胚大量繁殖H1N1流感病毒，甲醛灭活处理后，超速离心的方法制备灭活全病毒抗原。用上述抗原对5周龄Babl/c小鼠进行免疫，经脾细胞与骨髓瘤细胞融合、克隆化共筛选获得7株单克隆抗体。病毒中和滴定试验初步筛选出了3株与... 详细信息

本研究用9日龄鸡胚大量繁殖H1N1流感病毒，甲醛灭活处理后，超速离心的方法制备灭活全病毒抗原。用上述抗原对5周龄Babl/c小鼠进行免疫，经脾细胞与骨髓瘤细胞融合、克隆化共筛选获得7株单克隆抗体。病毒中和滴定试验初步筛选出了3株与流感病毒中和效果较好的单克隆抗体。以单抗杂交瘤细胞RNA反转录产物为模板，PCR成功扩增了轻(321 bp)、重链(360 bp)基因。选用(Gly4Ser),15肽序列的Linker序列，以重叠延伸拼接法成功组建了3条单链抗体基因，构建真核表达载体pCDNA31-ScFvo Lipoinfectamine2000转染MDCK细胞，在细胞水平上对3条单链抗体抗流感病毒活性进行了检测，间接免疫荧光实验结果表明单链抗体Q1-B1-BB具有一定的抑制流感病毒复制的能力，为以后小鼠模型验证其抗流感病毒活性奠定了基础，为抗流感转基因动物研究提供候选基因。

关键词：鸡流感病毒抗病毒基因单链抗体

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鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：文辉强武永淑张晓娜廉传江赵丽丽韩凌霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨 150001

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1... 详细信息

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1中的EcoRI酶切位点(GAATTC代替GAGTTC)为上下游引物5'端,经PCR反应得到DuCV全基因组,克隆构建于pMD 18-T载体中得到pMD-DuCV.以pMD-DuCV为模板,分别设计两对引物(引物位置不变,引物一的上下游分别含有XhoI和EcoRI位点,引物二的上下游分别含EcoRI和HindⅢ位点),分别经PCR反应得到两个DuCV全基因组,PCR产物分别用自带酶切、pEGFP-C1载体由XhoI和HindⅢ酶切后,三片段回收连接后得到双拷贝DuCV串联基因组感染性克隆pEGFP-2DuCV.经鸡胚成纤维细胞系(DF-1)与鸡马立克病毒肿瘤淋巴细胞系(MDCC-MSB1)体外转染试验验证,转染后12h均可观察到EGFP发出较强的绿色荧光.体外转染后验证病毒蛋白的表达、病毒传代以及超微形态学观察等是下一步进行病毒拯救研究重点.

关键词：鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆

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表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：孟庆文王伟田进王建超邓瑞坡陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，... 详细信息

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，并能检测到外源基因的表达;TG鸡与野生型(WT)鸡交配繁育F1代，经鉴定再用F1代TG鸡与WT鸡繁育F2代，现已繁育至F3代，建立微核心群单元，在每代TG鸡的血液与组织中均能够检测到外源基因的整合、表达，表明外源基因能稳定遗传;H5N1感染4周龄TG鸡与WT鸡，攻毒后观察到TG感染组鸡比WT感染组鸡的死亡时间延长;TG感染组咽拭子、肺组织病毒滴度显著低于WT感染组;对感染后各组鸡细胞因子进行检测，IFN-α与TNFα在TG组的表达量显著低于WT组，表明TG组鸡与WT组鸡相比病毒感染程度低，证明转基因鸡有抗禽流感病毒的作用。

关键词：转基因鸡抗禽流感病毒基因表达

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