检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2020年第2期50卷 183-188页

作者：佟相慧问婉欣陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结... 详细信息

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。

关键词：鸭瘟病毒鸭胚肝间充质干细胞主要组织相容性复合体单倍型

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实验牛微生物学和寄生虫学等级及监测地方标准的研究和制定

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实验动物科学 2021年第6期38卷 66-71页

作者：李昌文朱远茂夏长友陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

标准化是实验动物的根本属性,质量标准是实验动物质量控制体系中的重要组成部分,实验动物微生物和寄生虫控制水平是实验动物分级的根本依据。本文介绍了黑龙江省地方标准《实验动物牛微生物学等级及监测》和《实验动物牛寄生虫学等级及... 详细信息

标准化是实验动物的根本属性,质量标准是实验动物质量控制体系中的重要组成部分,实验动物微生物和寄生虫控制水平是实验动物分级的根本依据。本文介绍了黑龙江省地方标准《实验动物牛微生物学等级及监测》和《实验动物牛寄生虫学等级及监测》的编制背景、实验牛等级设定、检测项目的选择、检测方法、预期社会效益等主要内容。本标准的制定可为黑龙江省农业实验动物新资源提供标准及技术保障、为公共卫生和生物安全提供重要的基础条件、为重大动物疫病研究提供高质量实验动物以及为生物制品的研发、生产及检定提供标准化实验动物,进而推动我省及全国畜牧行业技术进步及畜牧业的健康发展。

关键词：实验牛微生物学寄生虫学地方标准

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利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

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中国兽医学报 2020年第2期40卷 257-263页

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光... 详细信息

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。

关键词： DDX21基因 H9N2亚型禽流感病毒 CRISPR/Cpf1 HEK293细胞基因敲除

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鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

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浙江农业学报 2020年第5期32卷 789-797页

作者：蒲路莎苏世博陈肖韩赵丽丽陈洪岩黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词：鹅星状病毒 ORF2 原核表达遗传进化分析

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抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的影响研究

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中国预防兽医学报 2020年第3期42卷 268-273页

作者：田丽娜王秀荣李广兴东北农业大学动物医学学院/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高... 详细信息

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+300 mg/kg Sublancin,H组)进行抗菌肽调控蛋鸡免疫的实验。实验持续30 d,分别在饲喂Sublancin后第1 d、15 d和30 d用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量;检测肝脏和脾脏指数;利用免疫印迹法检测每组鸡脾脏中干扰素γ(IFN-γ)表达;利用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中IL-2、IL-4和IL-6含量。结果显示:与C组比较,L组、M组和H组鸡血清中IgA、IgG和IgM含量、肝脏和脾脏指数、脾脏中IFN-γ的表达、血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量在饲喂Sublancin后第1 d均无显著变化(p>0.05),在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与L组比较,M组和H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与M组比较,H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均无显著变化(p>0.05)。实验表明饲粮中添加抗菌肽Sublancin可以显著增强蛋鸡免疫力,其添加浓度在100 mg/kg^200 mg/kg时,作用效果有剂量依赖性;但添加浓度在200 mg/kg^300 mg/kg时,作用效果与浓度无关。本研究为家禽养殖业中功能性饲料添加剂的开发及抗菌肽Sublancin在养殖业中的应用提供了新的参考依据。

关键词：抗菌肽 Sublancin 蛋鸡免疫功能

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鸡gga-miR-7b靶基因VDAC1-3’UTR双荧光素酶报告基因质粒的构建

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基因组学与应用生物学 2020年第2期39卷 533-538页

作者：肖春婷廉传江易诚陈洪岩东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

本研究以鸡gga-miR-7b作为研究对象,为了明确与肿瘤形成相关的关键基因VDAC1(Voltage-dependent anion channel 1)是否为gga-miR-7b的靶基因,深入研究gga-miR-7b对VDAC1基因的调控作用,本研究运用TargetScan和miRBD生物学软件预测了gga-miR-7b与VDAC1 m RNA的3’端非编码区(3’UTR)存在种子结合位点(GTCTTCC),并使用PCR克隆以及同源重组突变的方法构建VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒,经SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定及测序结果显示,片段大小符合且序列正确;成功构建了VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒并命名为pmirGLOVDAC1-wt3’UTR和pmirGLO-VDAC1-mut3’UTR。本研究结果进一步为gga-miR-7b候选靶基因VDAC1的鉴定以及功能研究提供理论依据。

关键词：马立克氏病 gga-miR-7b VDAC1基因 pmirGLO-VDAC1-wt-3’UTR pmirGLO-VDAC1-mut-3’UTR

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CAV-1感染MDCK中各IFN及受体分子表达谱的差异

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实验动物科学 2020年第3期37卷 1-5页

作者：孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的分析犬肾细胞系(MDCK)感染犬腺病毒1型(CAV-1)后各种干扰素(IFN)亚型及其受体分子转录水平的表达情况。方法建立犬IFN-β、IFN-β受体(IFNAR1)、IFN-λ1、IFN-λ1受体(IFN-λ1R)、IFN-λ3和IFN-λ3受体(IFN-λ3R)的染料法定量PCR方... 详细信息

目的分析犬肾细胞系(MDCK)感染犬腺病毒1型(CAV-1)后各种干扰素(IFN)亚型及其受体分子转录水平的表达情况。方法建立犬IFN-β、IFN-β受体(IFNAR1)、IFN-λ1、IFN-λ1受体(IFN-λ1R)、IFN-λ3和IFN-λ3受体(IFN-λ3R)的染料法定量PCR方法,分析了MDCK在PolyⅠ∶C处理和接种CAV-1后细胞内各IFN及受体分子转录水平的相对含量。结果正常MDCK细胞内存在较高含量的IFN-λ3R且含量显著高于其他IFN及受体分子的转录水平;用PolyⅠ∶C处理MDCK细胞24 h后,IFN-λ1R、IFN-λ3和IFN-λ3R的表达量均显著性上调,而IFN-β、IFN-λ1和IFNAR1几乎没变化;接种CAV-1后,IFN-α的含量急剧上升至6倍。结论MDCK细胞存在不同水平浓度的IFN分子及其受体转录产物,且在PolyⅠ∶C刺激和腺病毒感染时受体分子的表达谱不同。

关键词：犬肾细胞系干扰素受体转录表达水平

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利用CRISPR/Cas9技术构建流感病毒高产细胞系MDCK-Tpl2^(-/-)

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中国生物工程杂志 2019年第1期39卷 46-54页

作者：刘赛宝李亚芳王辉王伟冉多良陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根... 详细信息

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI=0. 1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2^(-/-));其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2^(-/-)细胞培养上清的血凝效价提高了1. 78～2. 5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2^(-/-)细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2. 8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。

关键词： Tpl2 CRISPR/Cas9 MDCK-Tpl2^-/-细胞细胞质控禽流感病毒

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主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单抗的制备

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中国实验动物学报 2019年第2期27卷 200-207页

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELIS... 详细信息

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于^(297)NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI^(322),对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。

关键词：主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单克隆抗体特异性

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MDA5基因敲除小鼠的构建

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新疆农业大学学报 2020年第4期43卷 270-274页

作者：田璐张子博史鑫琪郭慧娟陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

MDA5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进Ⅰ型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠MDA5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的s... 详细信息

MDA5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进Ⅰ型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠MDA5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的sgRNA和Cas9质粒的体外转录产物显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,8只F0代首建鼠中5号小鼠为MDA5基因敲除纯合小鼠;将其与野生型(WT)小鼠合笼繁育出MDA5^(+/-)小鼠,再通过全同胞合笼交配的方式获得纯合子小鼠。基因组PCR后检测显示F2代小鼠中有4只纯合小鼠,进一步RT-PCR结果显示MDA5敲除小鼠各脏器中MDA5基因均未表达,表明基于CRISPR/Cas9技术的MDA5基因敲除小鼠模型构建成功。为进一步研究MDA5在天然免疫应答机制和抗病毒感染等方面提供有价值的模型。

关键词： MDA5 CRISPR/Cas9 基因敲除动物模型

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