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第十二届中国实验动物科学年会

作者：孟庆文周长良王伟邓瑞坡臧凤霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨

目的建立H9N2亚型禽流感病毒感染海兰白鸡的感染模型,了解其对海兰白鸡的致病性,为评价抗流感转基因鸡研究奠定基础.方法将80只4周龄的海兰白鸡随机分为8组,每组10只,其中感染组5只,同居组5只;攻毒剂量为100 ～ 107 EID50/0.4mL,攻毒... 详细信息

目的建立H9N2亚型禽流感病毒感染海兰白鸡的感染模型,了解其对海兰白鸡的致病性,为评价抗流感转基因鸡研究奠定基础.方法将80只4周龄的海兰白鸡随机分为8组,每组10只,其中感染组5只,同居组5只;攻毒剂量为100 ～ 107 EID50/0.4mL,攻毒方式为滴鼻和点眼,感染24h后放入同居组.感染14d内每天进行临床观察,采集咽拭子和泄殖腔拭子用于病毒分离,感染后7、10、14d测定HI抗体滴度.结果 4周龄海兰白鸡感染H9N2流感病毒后未出现明显的临床症状;攻毒剂量为100～ 101 EID50/0.4mL的感染组和同居组均未分离到病毒;攻毒剂量为102～ 103 EID50/0.4mL的感染组排毒期为2～6d,同居组排毒期为4～ 6d;攻毒剂量为104 ～ 107 EID50/0.4mL感染组排毒期为1～ 6d,同居组排毒期为2～8d;攻毒剂量为102～107 EID50/0.4mL感染组和同居组鸡分别于感染后7和10d开始产生抗体,第14d感染组和同居组鸡的平均抗体滴度(log 2)分别为7.8±1.4和6.7±1.1.结论该毒株使4周龄海兰白鸡全部感染的最低攻毒剂量为103 EID50/0.4mL,以106 EID50/0.4mL的攻毒剂量感染鸡,能刺激感染组与同居组鸡产生较高的HI抗体,建立了海兰白鸡的H9N2亚型禽流感病毒感染模型,为H9N2亚型流感病毒的致病机理及表达抗流感基因的转基因鸡研究奠定了基础.

关键词： H9N2 禽流感病毒海兰白鸡感染传播

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兽用疫苗中实验动物替代方法的研究进展

兽用疫苗中实验动物替代方法的研究进展

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第八届北京实验动物科学国际论坛

作者：王兴童韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

本文介绍了兽用生物制品中非动物替代方法的应用及研究进展,并从兽用疫苗效力检验、安全检验方面介绍了部分兽用疫苗的非动物替代方法.同时对适合建立替代方法的兽用疫苗进行分析,以期为兽用疫苗替代方法研究提供参考.

关键词：兽用疫苗效力检验安全检验非动物实验

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鸭MHC基因型影响鸭肠炎病毒的体外增殖能力

鸭MHC基因型影响鸭肠炎病毒的体外增殖能力

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2016第十一届全国免疫学学术大会

作者：王兴童牛银杰彭蔚宇王丽廷孟兴赵丽丽韩凌霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队山西农业大学动物科技学院

背景/目的：主要组织相容性复合体(MHC)是紧密连锁、富含多种免疫相关蛋白的基因簇,其基因型对特定疫病的致病性或免疫应答水平密切相关.HBK-B1、B2、B3和B4鸭是以中国禽类实验动物种子选育的无特定病原体(SPF)绍兴麻鸭HBK-SPF鸭为基础...

背景/目的：主要组织相容性复合体(MHC)是紧密连锁、富含多种免疫相关蛋白的基因簇,其基因型对特定疫病的致病性或免疫应答水平密切相关.HBK-B1、B2、B3和B4鸭是以中国禽类实验动物种子选育的无特定病原体(SPF)绍兴麻鸭HBK-SPF鸭为基础,根据毗邻MHC Ⅰ类分子的抗原转运相关蛋白(TAP)基因的多态性选育成功的四个纯系SPF鸭群,具有MHC单倍型的遗传学特征.利用体内攻毒试验,B3系雏鸭对重组鸭肠炎病毒(DEV)载体表达的禽流感疫苗免疫产生的血凝抑制(HI)抗体明显高于其它3个品系.利用源自B3系和B1系HBK鸭的原代鸭胚成纤维细胞(DEF),体外比较对鸭肠炎病毒的复制能力的差异,筛选适合水禽免疫遗传学研究的实验动物.

关键词：

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表达抗菌肽cecropin-XJ转基因小鼠模型的鉴定分析

表达抗菌肽cecropin-XJ转基因小鼠模型的鉴定分析

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第十二届中国实验动物科学年会

作者：王伟尹海畅臧凤霞周长良陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

目的本研究鉴定分析制备的表达抗菌肽cecropin-XJ转基因小鼠，为利用转基因小鼠模型探讨抗菌肽的生物学功能及其抗菌机制奠定基础。方法在成功获得转基因小鼠的基础上，运用PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot方法对转基因小... 详细信息

目的本研究鉴定分析制备的表达抗菌肽cecropin-XJ转基因小鼠，为利用转基因小鼠模型探讨抗菌肽的生物学功能及其抗菌机制奠定基础。方法在成功获得转基因小鼠的基础上，运用PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot方法对转基因小鼠进行鉴定评价，选取阳性转基因小鼠与野生型(WT)小鼠杂交繁育F1代转基因小鼠。结果经PCR检测证实在转基因小鼠尾、肺、肝、心脏和脾脏均有外源基因的整合;RT-PCR证实抗菌肽基因在小鼠各组织细胞中转录;尾组织中Western blot同样证实了外源基因在转基因小鼠体内表达;共获得21只F0代小鼠，其中有5只小鼠在DNA、RNA以及蛋白水平的检测为阳性。结论本研究建立了转基因动物的检测方法，为进一步在体内评价抗菌肽抑菌活性奠定了基础。

关键词： cecropin-XJ 转基因小鼠模型

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抗流感病毒候选基因的筛选:单链抗体

抗流感病毒候选基因的筛选:单链抗体

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：王伟李越赵颖慧臧凤霞周长良孟庆文陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

本研究用9日龄鸡胚大量繁殖H1N1流感病毒，甲醛灭活处理后，超速离心的方法制备灭活全病毒抗原。用上述抗原对5周龄Babl/c小鼠进行免疫，经脾细胞与骨髓瘤细胞融合、克隆化共筛选获得7株单克隆抗体。病毒中和滴定试验初步筛选出了3株与... 详细信息

本研究用9日龄鸡胚大量繁殖H1N1流感病毒，甲醛灭活处理后，超速离心的方法制备灭活全病毒抗原。用上述抗原对5周龄Babl/c小鼠进行免疫，经脾细胞与骨髓瘤细胞融合、克隆化共筛选获得7株单克隆抗体。病毒中和滴定试验初步筛选出了3株与流感病毒中和效果较好的单克隆抗体。以单抗杂交瘤细胞RNA反转录产物为模板，PCR成功扩增了轻(321 bp)、重链(360 bp)基因。选用(Gly4Ser),15肽序列的Linker序列，以重叠延伸拼接法成功组建了3条单链抗体基因，构建真核表达载体pCDNA31-ScFvo Lipoinfectamine2000转染MDCK细胞，在细胞水平上对3条单链抗体抗流感病毒活性进行了检测，间接免疫荧光实验结果表明单链抗体Q1-B1-BB具有一定的抑制流感病毒复制的能力，为以后小鼠模型验证其抗流感病毒活性奠定了基础，为抗流感转基因动物研究提供候选基因。

关键词：鸡流感病毒抗病毒基因单链抗体

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原核系统表达的鸡白细胞介素-10的鼠抗血清体内研究的初步分析

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实验动物科学 2017年第3期34卷 1-5页

作者：王丽廷王兴童杨柳彭蔚宇孟兴陈洪岩高文伟韩凌霞山西农业大学动物科技学院太谷030801 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的获得鸡白介素-10(chIL-10)的原核表达产物,制备鼠抗血清,分析与真核系统表达的chIL-10的反应原性。方法采用RT-PCR从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中扩增编码成熟IL-10的基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),成功构建原... 详细信息

目的获得鸡白介素-10(chIL-10)的原核表达产物,制备鼠抗血清,分析与真核系统表达的chIL-10的反应原性。方法采用RT-PCR从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中扩增编码成熟IL-10的基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),成功构建原核重组质粒pET-chIL-10;转化至大肠杆菌DH5α中IPTG诱导表达,切下含有重组蛋白的SDS-PAGE胶条,免疫制备鼠抗血清;分别与包含信号肽和去除信号肽的chIL-10真核表达细胞系CHO-euchIL-10F和CHO-euchIL-10M进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(Western blot),验证有无反应性。结果成功构建chIL-10的原核表达载体pET-chIL-10,获得了高效价的鼠抗血清,能与表达chIL-10的真核细胞系反应。结论原核表达的chIL-10特异性鼠抗血清将能用于体内研究的检测。

关键词：鸡白介素-10 原核表达鼠抗血清体内实验

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鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：文辉强武永淑张晓娜廉传江赵丽丽韩凌霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨 150001

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1... 详细信息

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1中的EcoRI酶切位点(GAATTC代替GAGTTC)为上下游引物5'端,经PCR反应得到DuCV全基因组,克隆构建于pMD 18-T载体中得到pMD-DuCV.以pMD-DuCV为模板,分别设计两对引物(引物位置不变,引物一的上下游分别含有XhoI和EcoRI位点,引物二的上下游分别含EcoRI和HindⅢ位点),分别经PCR反应得到两个DuCV全基因组,PCR产物分别用自带酶切、pEGFP-C1载体由XhoI和HindⅢ酶切后,三片段回收连接后得到双拷贝DuCV串联基因组感染性克隆pEGFP-2DuCV.经鸡胚成纤维细胞系(DF-1)与鸡马立克病毒肿瘤淋巴细胞系(MDCC-MSB1)体外转染试验验证,转染后12h均可观察到EGFP发出较强的绿色荧光.体外转染后验证病毒蛋白的表达、病毒传代以及超微形态学观察等是下一步进行病毒拯救研究重点.

关键词：鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆

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表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：孟庆文王伟田进王建超邓瑞坡陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，... 详细信息

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，并能检测到外源基因的表达;TG鸡与野生型(WT)鸡交配繁育F1代，经鉴定再用F1代TG鸡与WT鸡繁育F2代，现已繁育至F3代，建立微核心群单元，在每代TG鸡的血液与组织中均能够检测到外源基因的整合、表达，表明外源基因能稳定遗传;H5N1感染4周龄TG鸡与WT鸡，攻毒后观察到TG感染组鸡比WT感染组鸡的死亡时间延长;TG感染组咽拭子、肺组织病毒滴度显著低于WT感染组;对感染后各组鸡细胞因子进行检测，IFN-α与TNFα在TG组的表达量显著低于WT组，表明TG组鸡与WT组鸡相比病毒感染程度低，证明转基因鸡有抗禽流感病毒的作用。

关键词：转基因鸡抗禽流感病毒基因表达

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TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响的初步分析

TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响的初步分析

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2016第十四届中国北方实验动物科技年会

作者：姜雪婷王伟李永青庞中兵孙海阳陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨 150001

目的：通过对TLR3基因敲除小鼠免疫相关指标分析,研究TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响,为应用敲除小鼠模型研究TLR3在病毒感染引发的天然免疫反应中的作用及病毒致病的分子机制奠定基础. 方法：PCR、测序分析敲除小鼠基因型;利用聚... 详细信息

目的：通过对TLR3基因敲除小鼠免疫相关指标分析,研究TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响,为应用敲除小鼠模型研究TLR3在病毒感染引发的天然免疫反应中的作用及病毒致病的分子机制奠定基础. 方法：PCR、测序分析敲除小鼠基因型;利用聚肌胞苷酸(Poly I：C)处理24h,通过自动血液计数仪测量分析外周血中淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞百分含量;Real-TimePCR检测TLR3信号通路中TRIF、IFN-β、Mx、IL-6和TNF-α相对表达情况;流式细胞术分析外周血中树突状细胞(CD86)、NK细胞(CD49)、淋巴细胞(CD3、CD8)比例变化. 结果：本实验所用TLR3基因敲除小鼠为纯合子(TLR3-/-),测序表明TLR3基因缺失13个碱基;在Poly I：C刺激下,TLR3-/-小鼠较WT小鼠外周血中淋巴细胞百分比显著降低,单核细胞中性粒细胞显著升高,脾脏中TRIF、IFN-β、Mx、IL-6和TNF-α表达量显著降低,外周血中CD86+细胞比例显著降低,CD49+细胞未见显著差异,细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)显著降低. 结论：在Poly I：C刺激条件下,TLR3基因缺失引起其下游信号转导通路变化,影响IFN-β基因表达及炎性因子的释放,从而影响小鼠免疫功能.

关键词：病毒感染免疫功能 TLR3基因敲除干扰素β 炎性因子

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谷氨酰胺对鸭瘟感染鸭十二指肠形态结构的影响

谷氨酰胺对鸭瘟感染鸭十二指肠形态结构的影响

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中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会

作者：张圆圆赵丽丽陆涛峰牛银杰韩凌霞刘胜旺陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队

目的为谷氨酰胺（Glutamine,Gln）在正常鸭及鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）感染模型中对肠道功能的影响研究提供依据。方法 120只无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）7日龄雏鸭随机分为8组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别梯度剂量灌... 详细信息

目的为谷氨酰胺（Glutamine,Gln）在正常鸭及鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）感染模型中对肠道功能的影响研究提供依据。方法 120只无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）7日龄雏鸭随机分为8组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别梯度剂量灌喂Gln（0、0.5、1、2 g每千克饲料每天）持续6d,及Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ组灌喂同等梯度剂量Gln 6d,于第一天灌喂30 min后攻鸭瘟病毒(2000TCID)0.2 mL,观察Gln对正常雏鸭的肠道结构保护作用及攻毒鸭肠道损伤的缓解作用。HE染色观察十二指肠肠壁结构形态,测定十二指肠绒毛高度和隐窝深度。结果 Gln的添加,缓解了十二指肠绒毛的蛋白样渗出现象和绒毛破损率;随着Gln添加量的增加,未攻毒组和攻毒组的十二指肠绒毛高度显著增加、隐窝深度降低、绒毛高度与隐窝深度的比值增加。结论Gln一定程度上保护了攻毒组十二指肠结构的完整性,维护了肠道结构。

关键词：谷氨酰胺鸭鸭瘟十二指肠肠道结构

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