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中国畜牧兽医学会2011年学术年会

作者：刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

猪圆环病毒2型(PCV2)主要引起以患猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统功能衰竭性疾病,临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎和渗出性表皮炎等,... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)主要引起以患猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统功能衰竭性疾病,临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎和渗出性表皮炎等,统称为猪圆环病毒病。本病于1991年在加拿大发现,相继北美、欧洲、亚洲等几乎所有养猪国家均有本病流行的报道。由于PCV2与其他多种病原混合感染情况不尽相同,猪群发表死亡率不等,较严重的地区暴病时死淘率高达40%,公认为继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后,新发猪的重要传染病。

关键词：猪圆环病毒病 PRRSV PCV 防控对策母源抗体断奶仔猪多系统衰竭综合征感染性分子克隆流行趋势

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重组猪圆环病毒2型表达V5表位标签的构建及其拯救毒株的体外生物学特性

重组猪圆环病毒2型表达V5表位标签的构建及其拯救毒株的体外生物...

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：黄立平陆月华郭龙军危艳武吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

猪圆环病毒2型(PCV2)是引发PMWS的主要病原.为了研究PCV2作为表达载体的可行性，构建了以PCV2基因组为骨架，在ORF2编码Cap蛋白的C末端插入了源自副流感病毒5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构建感染性分子克隆重组质粒转染细... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)是引发PMWS的主要病原.为了研究PCV2作为表达载体的可行性，构建了以PCV2基因组为骨架，在ORF2编码Cap蛋白的C末端插入了源自副流感病毒5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构建感染性分子克隆重组质粒转染细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，命名为recPCV2/CL-V5.采用免疫过氧化物酶单层试验(PMA)、血清中和试验(SNA)、捕获ELISA及免疫电镜对重组毒株进行了鉴定. 结果表明：在recPCV2/CL-V5株感染细胞中检出PCV2和V5表位抗原;PCV2阳性血清和中和性单克隆抗体(1D2)能够完全中和recPCV2/CL-V5株的细胞感染性;recPCV2/CL-V5株在繁殖动力学和形态学上与亲本病毒基本一致.鉴于recPCV2/CL-V5株插入了一个V5表位，采用PCR、IPMA和捕获ELISA与亲本毒株相鉴别.recPCV2/CL-V5株经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定，毒价可达106.25TCID50/mL.拯救的带有V5表位标签的重组PCV2毒株，为深入研究该病毒复制理、抗原表位展示及分子标记疫苗和鉴别诊断等开创了新的平台.

关键词：猪圆环病毒2型 V5表位标记毒株生物学特性

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猪输血传播病毒1型(PTTV1)Cap蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

猪输血传播病毒1型(PTTV1)Cap蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：张龙刘建波黄立平危艳武郭龙军吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

为了表达猪输血传播病毒1型(PTTV1)Cap蛋白用于单抗的制备,以含tTTV1全长基因组的重组质粒(pMD18-TTVl-SY13)为模板,用高保真PCR法扩增了PTTV10RF1 (1501～2475)编码的Cap蛋白C末端截短序列(324 aa),引物两端设计了Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切位... 详细信息

为了表达猪输血传播病毒1型(PTTV1)Cap蛋白用于单抗的制备,以含tTTV1全长基因组的重组质粒(pMD18-TTVl-SY13)为模板,用高保真PCR法扩增了PTTV10RF1 (1501～2475)编码的Cap蛋白C末端截短序列(324 aa),引物两端设计了Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点,将PCR产物克隆到pGEX-6P-1载体,构建了重组质粒(pGEX-TTVl-ORFl-C1).经序列验证的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株进行诱导表达,获得了融合GST的PTTVl-rCap重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析及Westem blot鉴定,目的蛋白获得了高效表达,分子量约64.0kDa,以包涵体形式存在.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得了8株稳定分泌抗PTTVl-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,依次命名为1H4、1E9、1E11、4G12、5C5、7B8、8C2、8G2,单抗亚类鉴定均为IgG1,轻链为K型;单抗培养上清效价为400～3200倍,腹水为4.0×105～6.4×106;其中有7株单抗与PTTVl-rCap蛋白产生特异性反应,另1株单抗(1E11)呈阴性,可能针对构象表位.本研究表达的PTTVl-rCap蛋白和制备的单抗,为进一步建立检测该病毒的诊断方法及抗原表位分析奠定了基础.

关键词：猪输血传播病毒1型(PTTV1) 重组Cap蛋白表达单抗制备

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒型共感染协同致病性研究

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒型共感染协同致病性...

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺... 详细信息

为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+ CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、 TNF-a、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。试验结果表明,HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60％;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-a)变化也最为明显。临床猪群中HP-PRRSV和PCV2普遍存在共感染,猪群感染HP-PRRSV后再感染PCV2,可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型共感染协同致病性

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猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆与拯救病毒的体外生物学特性

猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆与拯救病毒的体外生物学...

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：郭龙军陆月华危艳武黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明.采用感染性克隆技术构建了... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明.采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体外生物学特性试验.本研究构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4个克隆毒株，经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属于不同基因型代表毒株.这表明我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特性各异，构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病性差异奠定了基础.

关键词： PCV2 不同基因型感染性克隆病毒拯救生物学特性

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鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因突变对病毒体外复制的影响

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畜牧兽医学报 2011年第11期42卷 1577-1583页

作者：祁小乐高立吴关邓小芸余飞张礼洲秦立廷高玉龙王永强高宏雷刘娣华育平王笑梅东北林业大学博士后流动站黑龙江省农业科学院博士后工作站哈尔滨150086 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 黑龙江科技职业学院双城150111

为了进一步了解影响鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制效率和致病力的分子基础,作者在序列分析的基础上,利用反向遗传操作技术,针对VP2上2个重要的氨基酸位点(222和279),修饰和拯救了相应的2株突变病毒,并研究了突变病毒在体内外的生物学... 详细信息

为了进一步了解影响鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制效率和致病力的分子基础,作者在序列分析的基础上,利用反向遗传操作技术,针对VP2上2个重要的氨基酸位点(222和279),修饰和拯救了相应的2株突变病毒,并研究了突变病毒在体内外的生物学特性。复制动力学数据显示,VP2的222位由酪氨酸突变为脯氨酸可将IBDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制滴度提高6倍以上,而279位氨基酸对病毒复制效率无显著影响。SPF鸡的感染试验显示,222位和279位氨基酸与IBDV的致病力没有关系。本研究首次报道了VP2 222位和279位氨基酸与IBDV复制效率和致病力的关系,有助于更加全面地了解IBDV的基因功能,也将为新型IBDV疫苗的设计提供依据和思路。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因复制致病力反向遗传

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 227-231页

作者：高欲燃朱远茂康健史鸿飞李娇任宪刚冯军科于作薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化*** BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋... 详细信息

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化*** BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白多克隆抗体

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一株野鸭源基因Ⅲ型新城疫病毒主要生物学特性及基因组序列测定分析

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中国预防兽医学报 2011年第5期33卷 391-394页

作者：石跃刘怀然刘培欣李东伟杨煦华育平孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨150025

为研究分离自黑龙江三江自然保护区的野生绿头鸭粪拭子中的一株新城疫病毒(命名为Mallard/CH/HLJ383/06)主要生物学特性及基因组序列,本实验对病毒F基因序列进行测定,结果表明该病毒分离株属于NDV基因Ⅲ型,病毒的1日龄雏鸡脑内致病指数(... 详细信息

为研究分离自黑龙江三江自然保护区的野生绿头鸭粪拭子中的一株新城疫病毒(命名为Mallard/CH/HLJ383/06)主要生物学特性及基因组序列,本实验对病毒F基因序列进行测定,结果表明该病毒分离株属于NDV基因Ⅲ型,病毒的1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)为1.81,高于NDV中等毒力病毒株ICPI值,预示该病毒分离株毒力有增强趋势。15日龄SPF鸡致病性试验表明,该病毒分离株可导致雏鸡发病但不死亡,致病性仍低于与其ICPI值相近的基因Ⅶ型毒株。对该病毒分离株进行全基因组序列分析表明:该病毒分离株与Ⅰ系疫苗病毒Mukteswar、江苏2株基因Ⅲ型分离株(JS/7/05/Ch,JS/9/05/Go)结构蛋白氨基酸同源性高达99.0%～99.7%;与疫苗株Mukteswar相比,3株基因Ⅲ型病毒分离株在F蛋白中只有1个共同的氨基酸位点变异(A203T);HN蛋白中存在15个变异氨基酸,但位置各不相同;L蛋白中变异位点最多,为28个,其中有4个变异位点为3个分离株所共有。以上结果初步表明,Mallard/CH/HLJ383/06株可能是由疫苗株Mukteswar在野禽、家禽生态系统中传播进化而来,并由于宿主或免疫压力而发生毒力变异;分离株L蛋白氨基酸位点的变异,可能是导致病毒株毒力返强主要因素之一。

关键词：新城疫病毒野鸭基因Ⅲ型毒力基因组

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猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：张志榜陈建飞时洪艳陈小金冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001

根据猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白的基因组序列，设计一对引物，采用RT-PCR方法扩增出M基因，将其克隆至原核表达载体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M，经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3)，并进行IPTG诱导表达。结果表明重组菌pMXB-... 详细信息

根据猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白的基因组序列，设计一对引物，采用RT-PCR方法扩增出M基因，将其克隆至原核表达载体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M，经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3)，并进行IPTG诱导表达。结果表明重组菌pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)的分子质量约为951ku。在IPTG的浓度为0.8mmol/L，诱导时间为5h时，重组菌的表达效果最好，重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。Western-blot结果显示，rM能与兔抗PEDV多克隆血清及PEDVM蛋白单克隆抗体发生特异的免疫印迹反应，表明原核表达的rM蛋白具有良好的反应原性，为进一步开展关于PEDV M蛋白的研究奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒跨膜蛋白原核表达免疫印迹

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猪输血传播病毒2型(PTTV2)Cap蛋白在杆状病毒中的表达及活性测定

猪输血传播病毒2型(PTTV2)Cap蛋白在杆状病毒中的表达及活性测定

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：刘建波郭龙军危艳武黄立平吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室哈尔滨150001

PTTV1和PTTV2基因组结构相似,有3个大的开放阅读框(Open reading frames,ORFs)(ORF1、ORF2和ORF3),其中ORF1被认为是编码病毒壳体蛋白(Cap)的基因,ORF2编码可能病毒复制酶相关蛋白(Rep),ORF3编码蛋白与细胞凋亡有关.由于Cap蛋白为病毒... 详细信息

PTTV1和PTTV2基因组结构相似,有3个大的开放阅读框(Open reading frames,ORFs)(ORF1、ORF2和ORF3),其中ORF1被认为是编码病毒壳体蛋白(Cap)的基因,ORF2编码可能病毒复制酶相关蛋白(Rep),ORF3编码蛋白与细胞凋亡有关.由于Cap蛋白为病毒主要结构组成蛋白,能够刺激机体产生体液和细胞免疫反应,是建立检测诊断方法的理想靶抗原.为了开展该病毒血清学诊断方法的建立,本研究对PTTV2的ORF1基因进行扩增,并克隆到pBlueBac4.5N5-His TOPO TA载体,分别构建了PTTV2-ORF1全长序列(pBlueBac4.5N5-His-PTTV2-ORF 1-F)和截短的N端ORF1部分序列(pBlueBac4.5N5-His-PTTV2-ORF 1-S)的重组质粒.将上述2种重组质粒与Bac-N-BlueTM DNA共转染昆虫细胞(Sf21),经3次病毒蚀斑克隆,获得了2株重组杆状病毒,分别表达全长和截短的TTV2 Cap(rBlueBac-PTTV2-ORF1-F和rBlueBac-PTTV2-ORF1-S).重组杆状病毒毒种接种昆虫细胞进行重组蛋白表达,优化表达条件,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表明,表达的全长和截短重组蛋白分子质量分别为79kDa和43 kDa.在重组蛋白C末端设计了6 xHis-Tag标签,采用Ni2+亲和层析法进行了蛋白纯化.为该病毒血清抗体检测和疫苗免疫的研究奠定了基础.

关键词：猪输血传播病毒2型重组Cap蛋白杆状病毒表达

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