检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2011年第6期33卷 419-422页

作者：丛锋刘长军张艳萍李志杰张锋成云杨文闯许娜娜中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定鸡羽髓上皮细胞感染马立克氏病病毒(MDV)前后差异表达的蛋白,本研究以MDV强毒GA株人工感染SPF鸡,并通过双向电泳技术进行分析。结果显示:在病毒感染后4 d、7 d、14 d和21 d显著差异表达的蛋白点分别有2个、8个、25个和9个;而通过... 详细信息

为鉴定鸡羽髓上皮细胞感染马立克氏病病毒(MDV)前后差异表达的蛋白,本研究以MDV强毒GA株人工感染SPF鸡,并通过双向电泳技术进行分析。结果显示:在病毒感染后4 d、7 d、14 d和21 d显著差异表达的蛋白点分别有2个、8个、25个和9个;而通过质谱技术鉴定出29种蛋白质,其中包括能量代谢相关蛋白、增殖和凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、信号传导蛋白、转录相关蛋白、免疫相关蛋白和其他功能蛋白质。本实验首次对鸡羽髓上皮细胞感染MDV后各时期蛋白表达水平的变化进行研究,鉴定了多种差异表达蛋白质,为进一步揭示MDV与宿主的相互关系、感染性病毒粒子的成熟和致病机制提供了依据。

关键词：马立克氏病病毒羽髓上皮细胞双向电泳蛋白质组学

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禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2012年第9期42卷 916-920页

作者：贠炳岭刘文李德龙秦立廷刘在斯吴关祁小乐王永强高宏雷王笑梅高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒(ALV)的方法,以原核表达的HB09JY03(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法对p27的最小检出量... 详细信息

为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒(ALV)的方法,以原核表达的HB09JY03(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法对p27的最小检出量为1.25ng/mL,且与禽类常见的病毒鸡传染性支气管炎病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等无交叉反应。动物感染试验结果表明,用该方法可在感染动物12d后有效检测泄殖腔分泌物中的禽白血病病毒。利用该方法检测了491份蛋清样品和180份肛拭子样品,与PCR方法的符合率分别为96.5%和93.8%。证实,该方法具有方便、快速、敏感等优点,该方法的建立为ALV的早期诊断及种鸡场的净化提供了有效工具。

关键词：禽白血病病毒单克隆抗体多克隆抗体双抗体夹心ELISA

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蛋鸡J亚群禽白血病病毒HB09JY03株的分离鉴定及其全基因组序列分析

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中国兽医科学 2010年第11期40卷 1110-1114页

作者：潘伟高玉龙孙芬芬秦立廷祁小乐高宏雷王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用DF-1细胞系、ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光法,从湖北省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HB09JY03。为了解其分子特征,对其进行了全基因组测序,并与其他毒株进行了比... 详细信息

利用DF-1细胞系、ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光法,从湖北省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HB09JY03。为了解其分子特征,对其进行了全基因组测序,并与其他毒株进行了比较。结果表明,HB09JY03分离株的gag和pol基因非常保守,与各参考毒株的同源性为97.5%～99.0%;env基因的同源性为88.4%～97.5%;其3′UTR出现部分rTM区段缺失现象。与参考毒株相比,HB09JY03分离株与HPRS-103株的亲缘关系较近,可作为我国蛋鸡ALV-J株生物学特性和致病机制研究的良好材料。

关键词： J亚群禽白血病病毒蛋鸡分离鉴定全基因组序列分析

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 200-205页

作者：李娇薛飞朱远茂祖立闯中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到... 详细信息

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白截短表达鉴定

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 704-709页

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory ... 详细信息

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失 RT-PCR 鉴别诊断

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猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2009年第9期39卷 779-785页

作者：黄立平刘长明危艳武陆月华郭龙军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%... 详细信息

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验。用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%。另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%。表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重。

关键词：猪圆环病毒2型中和抗体单克隆抗体阻断ELISA

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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 665-670页

作者：吴国军蔡雪辉刘永刚王洪峰王淑杰石文达马平张琪李成君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行R... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 CH—1R株 ORF5 变异分析

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与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

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中国兽医科学 2013年第12期43卷 1211-1216页

作者：张辉唐青海危艳武黄立平张志慧刘建波吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库... 详细信息

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型茎环结构宿主细胞互作蛋白

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 152-158页

作者：危艳武刘长明范培虎吴洪丽温士刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/... 详细信息

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株细胞传代毒力试验

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猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 501-505,514页

作者：闫丽萍周艳君侯艳红华荣虹安同庆童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基... 详细信息

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。

关键词：繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因真核表达

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