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养猪 2009年第3期 65-68页

作者：苗岚飞胡守萍张超范张卓崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV-BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏... 详细信息

本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV-BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结,胎猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和小肠,进行组织病毒载量测定和组织病理学检测。实时定量PCR检测结果显示,攻毒组母猪的心脏、脾脏、肺脏、肾脏和子宫内膜存在病毒复制,子宫内病毒含量最高;胎猪的心脏、脾脏、肺脏中存在病毒复制。对照组脏器中无病毒复制。病理切片结果显示,攻毒组母猪肺脏出现细支气管性肺炎,脾脏出现淋巴细胞减少,心脏、肝脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结未见明显的组织病理学变化;胎猪的脏器未见明显的病理损伤。对照组未发现组织病理学变化。

关键词：猪细小病毒病毒组织分布组织病理学变化

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猪B7-H3分子胞外区的昆虫细胞表达及结晶

猪B7-H3分子胞外区的昆虫细胞表达及结晶

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第三届东北三省暨内蒙古自治区免疫学学术会议

作者：刘怀然张雯郝权刘恒贵张宏民中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室香港大学李嘉诚医学院生理系

B7家族是免疫系统中一类免疫调控分子,它们在各种免疫应答中发挥重要的免疫调节功能.B7-H3是最近发现的B7家族新成员,研究表明它在T细胞免疫应答中发挥着重要的调节功能.猪源B7-H3分子在猪体内有两种同型异构体,分别是2Ig和4Ig-B7-H3.... 详细信息

B7家族是免疫系统中一类免疫调控分子,它们在各种免疫应答中发挥重要的免疫调节功能.B7-H3是最近发现的B7家族新成员,研究表明它在T细胞免疫应答中发挥着重要的调节功能.猪源B7-H3分子在猪体内有两种同型异构体,分别是2Ig和4Ig-B7-H3.尽管猪B7-H3分子的免疫学功能已有报道,但是该分子发挥免疫学功能的结构基础还没有解析.本研究利用昆虫细胞-杆状病毒的Bac-to-Bac表达系统,将猪2Ig-B7-H3的第26～238位氨基酸和4Ig-B7-H3的第26～456位氨基酸的编码基因连接于分泌性表达载体pFastBac,在Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒后,在HF昆虫细胞中大量分泌表达猪B7-H3胞外区.表达蛋白经过Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化后进行晶体和X-射线衍射分析.研究结果表明昆虫细胞表达的2Ig和4Ig-B7-H3胞外区大小分别约为35kD和55kD,可被B7-H3的单克隆抗体及抗His单抗特异性识别.对2Ig-B7-H3胞外区蛋白尝试近1000个晶体筛选条件后,成功得到了该蛋白的单晶,并在上海光源收到了分辨率为3.1埃的衍射数据.这些研究结果为解析猪B7-H3的结构基础提供了可能,为我们今后从结构方面解释B7-H3的免疫学功能奠定了基础.

关键词： B7-H3 CD276 猪晶体解析

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定量分析马传贫病毒抗原捕获ELISA方法的建立

定量分析马传贫病毒抗原捕获ELISA方法的建立

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第十一届全国病毒学学术研讨会暨第六届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：胡哲常浩戈曼林跃智王雪峰郭巍王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病与慢病毒病研究创新团队哈尔滨150001

EIAV(马传贫)病毒与HIV病毒同属于逆转录病毒科慢病毒属,马传贫弱毒疫苗是目前世界上唯一成功应用的慢病毒疫苗,对于该疫苗作用机制的阐明将为艾滋病疫苗的研究提供借鉴.在基础研究和临床检测中,病毒载量的定量分析至关重要,以往对EIAV...

EIAV(马传贫)病毒与HIV病毒同属于逆转录病毒科慢病毒属,马传贫弱毒疫苗是目前世界上唯一成功应用的慢病毒疫苗,对于该疫苗作用机制的阐明将为艾滋病疫苗的研究提供借鉴.在基础研究和临床检测中,病毒载量的定量分析至关重要,以往对EIAV的检测方法有基于探针的荧光定量PCR,敏感特异,但价格昂贵;还有的方法因需要感染细胞或者测量量子点发射峰等,使得操作技术要求高、实验时间长而未得到广泛的应用,因此,急需建立一种特异、敏感和快速的马传贫病毒蛋白检测盒定量分析方法,为相关的慢病毒基础研究提供技术工具.

关键词：

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乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养... 详细信息

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养猪业遭受巨大损失。目前尚无简便快速的诊断方法和特效的治疗药物。E蛋白是主要的毒粒抗原,参与病毒复制的许多重要过程,包括受体结合、膜融合、毒粒包装等。E蛋白上有特异性抗体的中和表位,可诱导免疫动物产生中和抗体。E蛋白在体外进行高效表达不仅有利于该蛋白结构与功能的深入研究,而且有利于开发新型疫苗(亚单位疫苗)和诊断试剂的开发。为了对JEV E蛋白的免疫特性进行分析,本试验依据E蛋白的空间结构特点把全长E基因分成3段,成功地在***中高效融合表达EF1、EF2、EF3蛋白,通过Western blot和ELISA鉴定确定EF1、EF2融合蛋白与JEV阳性血清反应。且GST-EF2反应信号最强,而对照GST和GST-EF3没有反应。由于EF1片段长为873bp,所以将其进一步细分(EF1-1、EF1-2、EF1-3、EF1-4),每段间约有20bp的重叠,进行融合表达及检测,结果发现4段均与JEV阳性血清有强的反应性。通过本实验证明了EF1、EF2片段1～402aa是E蛋白中的免疫优势决定区,包括了12个Cys的保守区及域I、域П和域Ⅱ3个主要抗原域。通过Western blot和ELISA鉴定证明了表达的蛋白具有较好的抗原性。本研究结果对进一步进行鉴定E蛋白的抗原表位和基于这些抗原表位序列的应用研究具有重要意义。

关键词：乙型脑炎病毒 ELISA Western 抗原表位阳性血清分段表达免疫性

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反向遗传操作研究进展

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东北农业大学学报 2008年第1期39卷 134-138页

作者：吴波平时洪艳陈建飞冯力东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段。文章综述了反向遗传操作的研究策略,包括全长克隆的获得、体外转录和病毒的挽救,概括了反向遗传操作在病毒分子生物学研究... 详细信息

反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段。文章综述了反向遗传操作的研究策略,包括全长克隆的获得、体外转录和病毒的挽救,概括了反向遗传操作在病毒分子生物学研究、疫苗的研制、基因治疗和重组载体中的应用,分析了当前反向遗传操作研究中存在的问题。

关键词：反向遗传操作感染性克隆全长克隆体外转录病毒挽救

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表达鸡IFN-γ基因重组鸡痘病毒与鸡传染性法氏囊疫苗联合接种对鸡免疫应答的影响

表达鸡IFN-γ基因重组鸡痘病毒与鸡传染性法氏囊疫苗联合接种对鸡...

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十三次学术研讨会

作者：都兴洋石星明王云峰杨春富王玫童光志尹训南王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室内蒙古农业大学动物科学与医学学院

将表达鸡IFN-γ的重组鸡痘病毒（rFPV-IFN-γ）与鸡传染性法氏囊病MB活疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-Y对传染性法氏囊疫苗免疫效果的影响。结果,rFPV-IFN-γ（10～3PFU）和MB活苗联合免疫组(MBr+FPV-IFN-γ)以及重组干扰素（rIFN-γ... 详细信息

将表达鸡IFN-γ的重组鸡痘病毒（rFPV-IFN-γ）与鸡传染性法氏囊病MB活疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-Y对传染性法氏囊疫苗免疫效果的影响。结果,rFPV-IFN-γ（10～3PFU）和MB活苗联合免疫组(MBr+FPV-IFN-γ)以及重组干扰素（rIFN-γ,200U）和MB活苗联合免疫组(MB+rIFN-γ)在免疫后2周即可检出ELISA抗体,比MB单独免疫组早1周左右。在受到鸡传染性法氏囊病病毒Gx株攻击之后,MB+rFPV-IFN-γ免疫鸡和MB+rIFN-γ免疫鸡的脾脏只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解,少数滤泡萎缩变性坏死;胸腺结构清晰,仅有个别胸腺小体变性坏死,损伤程度轻于MB单独免疫组和非免疫对照组。疫苗免疫后1周,与非免疫对照相比3个免疫组外周血CD8T淋巴细胞含量均有显著上升,但CD4+T淋巴细胞含量变化却不明显;IBDV Gx株强毒攻击之后2周,3个疫苗免疫组CD4、CD8T淋巴细胞百分含量均显著升高,各组之间CD4、CD8T淋巴细胞百分含量无明显差异。结果表明,rFPV-IFN-γ和rIFN-γ可较全面地加强疫苗引起的免疫应答,加快疫苗诱导的体液免疫应答。

关键词：传染性法氏囊病病毒活疫苗 IFN-γ 免疫应答

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乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B;Japanese Encephalitis,JE）简称乙脑,是由乙型脑炎病毒（Epidemic Encephalitis B Virus;Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的中枢神经系统疾病,由蚊虫传播,主要流行于东亚和东南亚各国,近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势。感染后死亡率高,愈后患者会留下不同程度的后遗症。JEV的囊膜蛋白（即E蛋白）是乙脑病毒的主要结构蛋白,它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。1999年Kolaskar等[1]通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测,认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成,其中结构域Ⅱ独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样结构,由于这种构象,许多抗原中和表位都集中于此结构域。目前对于E蛋白的结构域Ⅱ（EⅡ）的抗原表位还不清楚,为了对结构域Ⅱ进行抗原表位研究,首先原核克隆表达了EⅡ,结果表明,原核表达产物可被抗JEV阳性血清识别。并且利用一组覆盖该区域的短肽融合蛋白通过蛋白免疫印迹和ELISA反应,进行表位鉴定,同时也对结构域Ⅱ的免疫特性进行了研究。为了对EⅡ（292～402氨基酸残基）这一长111氨基酸残基的片段进行抗原表位作图,设计了一套覆盖整个EⅡ的短肽组,命名为E3750,这些短肽长为16个氨基酸,相互重叠8个氨基酸。为了表达这些短肽,设计合成了14对寡核苷酸链。在编码链的5'端引入BamH I位点,在3'端引入XhoI位点,反义链与编码链互补,且退火后形成的双链DNA正向为BamH I粘性末端,反向为XhoI粘性末端,可直接与酶切线性化处理的载体pGEX-6P-1相连接。重组子经酶切鉴定后命名为pGEX-E37至pGEX-E50,各重组质粒送北京英骏生物技术有限公司测序以验证序列。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21,进行诱导表达及SDS-PAGE电泳分析各短肽蛋白表达情况。从分析结果看各融合蛋白均获得了表达,可溶性短肽融合蛋白用谷胱甘肽Sepharose4B RediPack亲和层析柱（Pharmacia Biotech）纯化,不溶性短肽融合蛋白经超声波洗涤纯化.纯化样品与1:100稀释的JEV阳性血清进行蛋白质免疫印迹和ELISA分析,结果表明,表达融合蛋白GST-E39（305～320）,GST-E45（353～368）,GST-E47（369～384）,GST-E48（377～392）,和E49（385～402）能被JEV阳性血清所识别。由于GST-E47、GST-E48、GST-E49是一个连续的氨基酸序列,为了确定抗原表位的主要功能性区域,将该段氨基酸进一步划分,通过蛋白质印迹结果表明该区域含有两个抗原表位,即GST-E48-1（377～384）、GST-E49（385～402）。同时,由于鉴定出的表位E45（353～368）的融合蛋白以包涵体的形式存在对E45进行相应的细分,蛋白质印迹结果发现E45-1（355～366）能被JEV阳性血清所识别。14个相互重叠且覆盖EⅡ全长区域的短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹及ELISA扫描,以及通过免疫印迹进一步精确定位后,最终确定GST-E39、GST-E45-1、GST-E48-1、GST-E494个抗原表位,表位作图如下其结果对进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有重要意义。

关键词：抗原表位结构域免疫印迹 ELISA 乙型脑炎病毒阳性血清 JEV

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鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA文库的构建

鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA文库的构建

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中国畜牧兽医学会禽病分会第十三次学术研讨会

作者：高玉龙刘伟高宏雷邓小芸李铁强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的危害雏鸡的一种急性、高度接触性病毒性传染病.该病主要引起3～8周龄的鸡发病,导致死亡和引起免疫抑制,并可诱发... 详细信息

传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的危害雏鸡的一种急性、高度接触性病毒性传染病.该病主要引起3～8周龄的鸡发病,导致死亡和引起免疫抑制,并可诱发多种鸡病或使多种疫苗免疫失败.此外,由于近年来变异株和超强毒株的流行,常使IBD免疫鸡群发病,病死率升高达80％以上,严重威胁着养鸡业的发展. IBDV主要侵害鸡的中枢免疫器官-法氏囊,对法氏囊中的B淋巴细胞具有很强的亲嗜性.Kaufer等研究证实,切除法氏囊的鸡可以耐过IBDV的感染,仅有轻微的病理变化,但可以产生抗体.法氏囊是IBDV感染宿主及其复制的组织基础,B淋巴细胞上存在IBDV病毒细胞受体,与病毒的结合、侵入以及复制有关. 本研究从3周龄SPF鸡的法氏囊中分离B淋巴细胞,运用Gateway技术构建了鸡法氏囊B淋巴细胞三框表达cDNA文库,为研究IBDV与宿主相互作用以及筛选病毒受体奠定了基础.

关键词：鸡传染性法氏囊病淋巴细胞 cDNA文库

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鹌鹑β-防御素9重组蛋白的原核表达及其生物学特性的初步研究

鹌鹑β-防御素9重组蛋白的原核表达及其生物学特性的初步研究

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低碳经济与高效养殖——第六次全国饲料营养学术研讨会暨动物营养学分会成立三十周年大会

作者：王瑞琴蔺丽娟周财源韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动科院动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本研究采用RT-PCR法,首次从鹌鹑肺脏和骨髓组织中扩增到一个新的鹌鹑β-防御素基因。经核苷酸序列测定,得到鹌鹑β-防御素cDNA的序列,由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基,序列覆盖编码区全长,其中有8个带正电荷的氨基酸残基,4个带负电... 详细信息

本研究采用RT-PCR法,首次从鹌鹑肺脏和骨髓组织中扩增到一个新的鹌鹑β-防御素基因。经核苷酸序列测定,得到鹌鹑β-防御素cDNA的序列,由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基,序列覆盖编码区全长,其中有8个带正电荷的氨基酸残基,4个带负电荷的氨基酸残基。其分子量为7273.55,等电点pI为8.29。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素9的氨基酸序列构建系统进化树,经分析<正>本研究采用RT-PCR法,首次从鹌鹑肺脏和骨髓组织中扩增到一个新的鹌鹑β-防御素基因。经核苷酸序列测定,得到鹌鹑β-防御素cDNA的序列,由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基,序列覆盖编码区全长,其中有8个带正电荷的氨基酸残基,4个带负电荷的氨基酸残基。其分子量为7273.55,等电点pI为8.29。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素9的氨基酸序列构建系统进化树,经分析

关键词：鹌鹑 β-防御素组织分布重组蛋白抗菌活性

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鹌鹑β-防御素10基因的克隆及其生物学作用的初步研究

鹌鹑β-防御素10基因的克隆及其生物学作用的初步研究

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低碳经济与高效养殖——第六次全国饲料营养学术研讨会暨动物营养学分会成立三十周年大会

作者：蔺丽娟王瑞琴周财源韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动科院动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性... 详细信息

本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性最高,达83.8%。我们将其命名为鹌鹑AvBD10。<正>本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性最高,达83.8%。我们将其命名为鹌鹑AvBD10。

关键词：鹌鹑AvBD10 重组蛋白抗菌活性

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