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第三届(2012)中国白羽肉鸡产业发展大会暨第二届全球肉鸡产业论坛

作者：贠炳岭 YUN Bing-ling LIU Wen 刘文 LI De-long 李德龙 QIN Li-ting 秦立廷 L1U Zai-si 刘在斯 WU Guan 吴关 QI Xiao-le 祁小乐 WANG Yong-qiang 王永强 GAO Hong-lei 高宏雷高玉龙 GAO Yu-long WANG Xiao-mei 王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 Division of Avian Infectious Diseases State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology Harbin Vete

本文为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒的方法,以原核表达的HLJ09MDJ-1(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法.该方法对p27的最小检出量... 详细信息

本文为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒的方法,以原核表达的HLJ09MDJ-1(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法.该方法对p27的最小检出量为1.25ng/ML,且与禽类常见的病毒(IBV,MDV,ILTV等)无交叉反应.动物感染实验结果表明该方法可在感染动物12天后有效检测泄殖腔分泌物中的ALV.利用该方法检测了491份蛋清样品和180份肛拭子样品,与PCR方法符合率分别为96.5％和93.8％.结果表明,该方法具有方便、快速、敏感等优点,该方法的建立为ALV的早期诊断及种鸡场的净化提供了有效工具.

关键词：禽白血病病毒早期诊断抗体检测双抗体夹心法

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨 150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域... 详细信息

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,本实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和ELISA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出E39(<'305>TEKFSFAKNPVDTGHG<'320>)、E45-1(<'355>VTVNPFVATSSA<'366>)、E48-1(<'377>PFGDSYIV<'384>)和E49(<'385>VGRGDKQINHHWHKAG<'400>)四个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明E39为具有病毒中和活性的抗原表位.本试验结果为进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.

关键词：流行性乙型脑炎病毒 E蛋白结构域Ⅲ 抗原表位鉴定免疫印迹表位疫苗

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雪山草鸡感染传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定

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中国动物检疫 2021年第5期38卷 119-125页

作者：姜楠王雨龙张文英牛鑫鑫刘长军高玉龙高立崔红玉李凯潘青张艳萍刘爱晶王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所世界动物卫生组织传染性法氏囊病参考实验室黑龙江哈尔滨150069 扬州大学江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)新型变异株正在我国广泛蔓延,给商品肉鸡群和蛋鸡群带来了新的威胁。本研究对一个疑似发生非典型传染性法氏囊病的地方品种雪山草鸡群进行了RT-PCR检测,并对分离的3株毒株进... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)新型变异株正在我国广泛蔓延,给商品肉鸡群和蛋鸡群带来了新的威胁。本研究对一个疑似发生非典型传染性法氏囊病的地方品种雪山草鸡群进行了RT-PCR检测,并对分离的3株毒株进行了基因测序及序列分析。结果显示,引起该鸡群发病的病原是IBDV新型变异株,属于A2dB1基因型;这3个毒株的VP2高变区编码蛋白上含有IBDV变异株的特征性氨基酸,也具有IBDV新型变异株的独特氨基酸。结果提示,我国地方品种鸡群中也有IBDV新型变异株的流行,现有的部分商品化IBDV疫苗已不能有效预防IBDV新型变异株的流行。

关键词：传染性法氏囊病病毒新型变异株 A2dB1基因型雪山草鸡

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检测猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

检测猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR...

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：刘杉杉赵亚荣吕超超王贵华胡峰蔺文成王晓玲崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 大北农动物医学中心北京 100097

猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪捷申病毒(PTV)是严重危害中国养猪业的重要病毒，经常继发或者混合感染。为了建立同时检测PTV、CSFV和PRRSV的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法，本试验根据国内外发表的有关检测PRRSV、C... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪捷申病毒(PTV)是严重危害中国养猪业的重要病毒，经常继发或者混合感染。为了建立同时检测PTV、CSFV和PRRSV的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法，本试验根据国内外发表的有关检测PRRSV、CSFV和PTV的引物．对比GenBank中登录的这3种病毒的序列。选出3对引物．通过优化反应条件，建立了检测这3种病毒的mRT-PCR检测方法，并进行了特异性试验和敏感性试验。特异性试验表明，mRT-PCR可以特异扩增出PRRSV ORF6基因45lbp片段、CSFV Ems基因343bp片段、PTV 5 -UTR基因163bp片段，而对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒不能扩出;敏感性试验表明，mRT-PCR方法中3种病毒的最低核酸检出量分别是7.11×102(PRRSV),7.8l×103，(CSFV)，8.43×102(PTV)拷贝数/μL，比单个RT-PCR敏感性略低。利用该方法对69份送检病料样品进行检测，其中PRRsV和CSFV混合感染检出率为4.35％。PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59％，CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04％，3种病毒的混合感染检出率为8.70％，与单个RT-PCR检测结果对比，符合率为98．6％。该方法快速简便，可以作为疾病的初步筛选。对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪繁殖障碍 RNA病毒多重RT-PCR检测临床应用

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果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：邵昱昊韩宗玺陈露菲孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江省疾病预防控制中心

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣... 详细信息

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,具有呼肠孤病毒的形态特征,将病毒命名为Masked Palm Civet/China/2004(MPC/04)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞,这与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的红细胞凝集谱相符。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒未丧失感染能力;1mol/LMgCl2能提高病毒对热的抵抗力。为了进一步从分子水平上证实该病毒是呼肠孤病毒,用哺乳动物呼肠孤病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST比较,选取同源性较高者进行序列同源性分析,发现该片段与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型参考毒株核苷酸同源性最高。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。

关键词：果子狸呼肠孤病毒分离鉴定

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副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的初步鉴定

副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的初步鉴定

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：郑楠符芳柴政姜福成王香玲张雪云王卓李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江八一农垦大学哈尔滨师范大学

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株。Westernblot结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫... 详细信息

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株。Westernblot结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb所识别蛋白为ATP结合盒转运蛋白(ABCT)家族的寡肽透过酶(OppA);利用MAb对噬菌体12肽库进行淘选,8个阳性噬菌体克隆展示有"KTPAE-R"保守序列,对应于***29755株和SH0165株的469位～475位的氨基酸残基。对OppA氨基酸序列比对结果表明***与其它10种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1%～74.5%,本研究结果为进一步研究***感染的病原学诊断建立了良好的基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 ABCT OppA 病原学诊断

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非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

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中国畜牧兽医学会信息技术分会2012年学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东刘业兵崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室青岛农业大学动物科技学院中国兽药监察所

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨基酸残基之间。应用PCR技术,扩增出P54基因跨膜信号肽缺失片段,经克隆和测序后构建出重组表达质粒pET-P54q,与P54全长序列的原核表达质粒pET-28b-P54,转化Rostta表达菌。重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-28b-P54的表达量较少,而pET-P54q表达量较高。用钴柱亲和层析纯化,得到跨膜信号肽缺失的P54融合蛋白。P54是主要免疫原,可以用于血清学检测,鉴于我国目前不能引进病毒,因此P54蛋白也具备作为亚单位疫苗的可能性。同时基于非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因,建立了纳米PCR检测方法,该方法特异性强,敏感性高,检测下限均达10～1copies/μL,是常规PCR检测技术敏感性的1000倍。对黑龙江、吉林和河南三个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54 纳米PCR 原核表达

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猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 m... 详细信息

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 mM、温度为37℃、诱导4 h时表达量最大，分子量为25 ku;pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 mM、温度为37℃、诱导4h时表达量最大，融合蛋白的分子质量为19．4ku。对表达的可溶性蛋白，用钴柱亲和层析纯化得到了NS2、NS3的重组蛋白，western blot鉴定表明，重组蛋白具有反应原性。本研究为猪细小病毒的自然免疫、发病机制、病毒复制、免疫机理等研究工作奠定了基础，未见以前有所报道。

关键词：猪细小病毒非结构蛋白基因克隆原核表达

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猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：唐青海张彦明郭抗抗何雷范丽仝刚代晨西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG13... 详细信息

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG132能够诱导正常猪血管内皮细胞及稳定表达CSFV E2蛋白和GFP蛋白的细胞株的凋亡,而且,凋亡率呈MG132剂量依赖性增加。而稳定表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132诱导的细胞凋亡。深入的研究还显示,表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132对宿主细胞NF-κB活性的抑制作用,而且,表达NS2蛋白细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量比照组细胞增加了48倍～51倍。该研究表明,CSFV NS2蛋白在抑制宿主细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词：猪瘟病毒 NS2蛋白 MG132 凋亡 Bcl-2

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同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：成丹赵建军李娜孙元周艳君朱妍田志军涂长春童光志仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室新疆农业大学动物医学院军事医学科学院军事兽医研究所

本研究应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2TCID50的猪瘟病毒和1.8TCID50的北... 详细信息

本研究应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2TCID50的猪瘟病毒和1.8TCID50的北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT-PCR方法对155份现地样品进行检测,73份为CSFV阳性,16份为PRRSV阳性,与常规RT-PCR的符合率高达99.4%。该复合荧光定量RT-PCR方法敏感、特异、重复性好。

关键词：猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒复合荧光定量RT-PCR

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