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2014年中国畜牧兽医学会养猪学分会学术研讨会

作者：王香玲柴政田华彬符芳姜福成郑楠张雪云郭佃磊李昆鹏李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨 150025 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆 163319

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保... 详细信息

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保存的猪源抗体恒定区连接.通过Linker序列[(Gly4Ser)3],最终将重链和轻链连接,构成H-linker-L.将该序列连接到原核表达载体pET-28a进行原核表达,纯化.Western-blot鉴定结果表明,该重组蛋白能够与兔抗猪IgG二抗反应.这说明构建的重组抗体确实为猪源抗体.

关键词：猪源抗体基因克隆大肠杆菌 B淋巴细胞

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山羊痘基因工程标记疫苗的初步研究

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0015-I0015页

作者：王芳刘胜旺邵昱昊陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

为了有效地预防和根除山羊痘,研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因克隆、鉴定的基础上,构建转移载体。将痘苗病毒(Vaccinia Virus,VV)晚期... 详细信息

为了有效地预防和根除山羊痘,研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因克隆、鉴定的基础上,构建转移载体。将痘苗病毒(Vaccinia Virus,VV)晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点,经酶切、PCR鉴定出,命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸(bovine testes,BT)细胞,待出现80%以上的细胞病变时收获病毒,经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定,获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒,命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示,LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力、生长特性与亲本株相似,保持原有疫苗株的生长特性,而且在BT细胞和羔羊睾丸(lamb testes,LT)细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物,为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。

关键词：重组山羊痘病毒标记疫苗胸苷激酶基因(TK) β-半乳糖苷酶基因(LacZ)

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山羊干扰素-γ的克隆、原核表达及其抗血清的制备

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0061-I0061页

作者：金标刘胜旺海岗王芳陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

应用RT-PCR方法从免疫过山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊干扰素-γ(IFN-γ)基因,经序列测定,其开放阅读框架共有501bp,推测其分子质量(MW)为19.327KD。该基因与GenBank发表的山羊干扰素-γ基因序列(U34232)比较,核苷酸序列同源性为99.4... 详细信息

应用RT-PCR方法从免疫过山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊干扰素-γ(IFN-γ)基因,经序列测定,其开放阅读框架共有501bp,推测其分子质量(MW)为19.327KD。该基因与GenBank发表的山羊干扰素-γ基因序列(U34232)比较,核苷酸序列同源性为99.4%。经SignalP3.0分析表明,前23个氨基酸为信号肽序列。将信号肽序列去除并克隆到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果表明该基因在大肠杆菌中以包涵体形式融合表达。用ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化并免疫新西兰兔,制备了兔抗山羊IFN-γ多克隆血清。经WesternBlot鉴定,多克隆抗血清可与纯化的山羊IFN-γ蛋白发生特异性反应,说明该重组蛋白具有抗原活性,为我们进一步研究其在疾病诊断和免疫评价方面的应用奠定了基础。

关键词：山羊干扰素γ 原核表达抗血清

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野鸭源禽网状内皮组织增生症病毒的分离与鉴定

引用

中国畜牧兽医文摘 2014年第11期30卷 66-66页

作者：姜莉莉祁小乐高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒（REV）长末端重复序列（LTR）的特异性引物作为检测引物，对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测。阳性样品经DF1培养增殖，进行病毒的分离，经PCR和间接免疫荧光（IFA）方法鉴定，确定分... 详细信息

利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒（REV）长末端重复序列（LTR）的特异性引物作为检测引物，对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测。阳性样品经DF1培养增殖，进行病毒的分离，经PCR和间接免疫荧光（IFA）方法鉴定，确定分离到2株REV，分别来自于针尾鸭和绿头鸭，将分离病毒分别命名为DBYR1101和DBYR1102。克隆2个病毒株的主要保护性抗原基因gp90，并进行序列分析。结果显示，2个分离株gp90基因氨基酸相似性为99．5％；DBYR1101gp90基因与REV3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95．7％、94．2％和98．2％；DBYR1102gp90基因与REV3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸相似性分别为95．2％、93．7％和97．7％；与中国早期南方分离株HA9901的氨基酸序列相似性分别为94．7％和94．2％；与中国北方分离株氨基酸序列相似性为99．2％-100％。核苷酸遗传进化分析表明，2个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近，趋于形成1个北方分离群；与SNV株亲缘关系最远；与170A株亲缘关系较远；与美国和中国台湾地区的某些分离株相似性较高。该研究首次自野鸭体内分离NREV，丰富了REV流行病学资料，同时提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色，为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒分离株鉴定鸭源 gp90基因序列相似性间接免疫荧光 PCR检测

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鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

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中国科技成果 2009年第21期10卷 8-8页

作者：王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划... 详细信息

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划课题（课题名称：鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗的研制）的支持（2001～2005年）和农业科技成果转化资金项目课题（课题名称：传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二价疫苗）（2001年～2003年）的资助。

关键词：鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗重组鸡痘病毒农业科技成果转化资金项目国家863计划马立克氏病亚单位疫苗病毒载体

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山羊IL-2基因的克隆、表达及其多克隆抗血清的制备

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0060-I0060页

作者：海岗刘胜旺陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因并测序,将编码山羊白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pET30a(+)上,构建重组质粒并进行确证性测定。然后将重... 详细信息

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因并测序,将编码山羊白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pET30a(+)上,构建重组质粒并进行确证性测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE分析显示,表达的山羊IL-2融合蛋白分子量约为18kD。包涵体被6mol/L盐酸胍裂解后,通过ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化。用所获得的重组山羊IL-2纯化产物经3次肌内注射新西兰白兔,制备了兔抗山羊IL-2多克隆血清,并用Western blot进行了证明。本次试验成功地表达、纯化了山羊IL-2融合蛋白,并制备了抗山羊IL-2多克隆抗血清,为下一阶段关于山羊IL-2重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。

关键词：山羊IL-2 融合蛋白原核表达抗血清

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基于ASFV转录报告系统的高通量筛选将臭椿酮鉴定为一种广谱抗病毒化合物

基于ASFV转录报告系统的高通量筛选将臭椿酮鉴定为一种广谱抗病毒...

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十三次全国会员代表大会暨第十七次学术研讨会

作者：张宇航张振江张帆张继文焦俊侯敏钱年超赵东明郑晓峰谭旭湖南农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室清华大学医学院传染病研究中心清华大学药学院北京市结构生物学高精尖创新中心清华大学-北京大学生命科学联合中心合肥综合性国家科学中心大健康研究院

非洲猪瘟(ASF)是一种急性、高度传染性和致命的猪病毒性疾病,正在严重危害全球养猪业。但是,目前为止没有可用于ASF防控的权威疫苗和抗病毒药物。非洲猪瘟病毒(ASFV)是ASF的病原体,在ASFV蛋白中,p72是病毒体中最丰富的成分,不仅占病毒...

非洲猪瘟(ASF)是一种急性、高度传染性和致命的猪病毒性疾病,正在严重危害全球养猪业。但是,目前为止没有可用于ASF防控的权威疫苗和抗病毒药物。非洲猪瘟病毒(ASFV)是ASF的病原体,在ASFV蛋白中,p72是病毒体中最丰富的成分,不仅占病毒颗粒总质量的32%,还是病毒组装过程中的关键衣壳蛋白,因此是抗ASFV药物设计的潜在靶标。本研究中,我们构建了一个由p72启动子驱动的荧光素酶报告系统(p72-Fluc),该系统由共转染的ASFV RNA聚合酶复合物驱动转录。使用该系统,我们筛选了3000多种化合物并获得了三种有效的抗ASFV化合物。我们进一步评估了三种化合物抗ASFV的效果,并证明在三个候选物中,臭椿酮(AIL)在纳摩尔浓度下能有效抑制p72-Fluc系统的荧光强度和ASFV的复制(IC50=15 nmol/L)。此外,采用中国流行毒株ASFV-HLJ-2018毒株进一步评估AIL对野生毒株ASFV的抗病毒作用,血细胞吸附试验和蛋白质印迹试验结果表明,AIL可以剂量依赖性方式有效抑制该野生型ASFV毒株的复制。据报道,AIL会抑制HSP90与其辅助伴侣蛋白p23之间的相互作用,并导致HSP90的客户蛋白错误折叠或降解。我们在体外实验中,通过过表达和敲低HSP90的辅助伴侣蛋白p23,发现过表达p23能显著上调p72-Fluc系统的荧光强度和ASFV的感染比例,而敲低p23会下调p72-Fluc系统的荧光强度和ASFV的复制,表明AIL的抗病毒作用与其抑制HSP90-p23辅助伴侣蛋白有关,p23促进ASFV的复制并缓解AIL的抑制作用。近百种病毒蛋白已被报道为HSP90伴侣循环的客户蛋白,由于p23既是HSP90伴侣循环的重要元件也是AIL的靶标,我们推测AIL有可能成为一种广谱抗病毒药物,并评估了其对寨卡病毒(Zika)和乙型肝炎病毒(HBV)的抗病毒能力。结果表明,AIL对寨卡病毒和乙型肝炎病毒具有显著的抗病毒活性,进一步证明AIL是一种潜在的广谱抗病毒剂。据我们所知,这是第一份关于AIL广谱抗病毒作用的报告。未来的研究可能探索AIL作为抗病毒药物的精确分子机制和临床效果。

关键词：

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