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鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB_(43)弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

中国兽医科学 2007年第1期37卷 33-37页

作者：都兴洋石星明王云峰杨春富王玫童光志尹训南王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

将重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与IBD MB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示,rFPV-IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rFPV-IFN-γ)及rIFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rIFN-γ)在免疫后... 详细信息

将重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与IBD MB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示,rFPV-IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rFPV-IFN-γ)及rIFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rIFN-γ)在免疫后第2周即可检出ELISA抗体,比MB43疫苗单独免疫组早1周。用IBDV Gx株攻击后,MB43+rFPV-IFN-γ组和MB43+rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解,少数滤泡萎缩变性坏死;胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组。免疫后1周,3个免疫组外周血CD8+T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组,CD4+T淋巴细胞含量变化不明显;攻毒后第2周,3个疫苗免疫组CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均显著升高,各组之间CD4+、CD8+T淋巴细胞含量无明显差异。证实,rFPV-IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。

关键词：传染性腔上囊炎病毒弱毒疫苗鸡IFN-γ 免疫应答

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猪繁殖-呼吸综合征活疫苗对仔猪的安全性试验

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中国预防兽医学报 2006年第3期28卷 341-343,346页

作者：王洪峰蔡雪辉刘永刚李艳华柴文君温永俊尹训南褚桂芳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

本试验用猪繁殖-呼吸综合征(PRRS)活疫苗和国内分离的PRRS强毒CH-1a株接种PRRS阴性的断奶仔猪,分别在接种后的3、7、14d各剖杀1头,取各脏器分别做冰冻切片和病理切片观察。用间接免疫荧光法检测各脏器PRRS病毒的分布。结果表明,PRRS活... 详细信息

本试验用猪繁殖-呼吸综合征(PRRS)活疫苗和国内分离的PRRS强毒CH-1a株接种PRRS阴性的断奶仔猪,分别在接种后的3、7、14d各剖杀1头,取各脏器分别做冰冻切片和病理切片观察。用间接免疫荧光法检测各脏器PRRS病毒的分布。结果表明,PRRS活疫苗在免疫初期,抗原主要分布在脾脏、淋巴结,其次是肾脏和肺脏,少见于肝脏和心脏,第14d时在脾、淋巴结和肾脏有一定量的抗原,而肺脏相比则数量很少,肝脏和心脏未检到PRRS病毒抗原的存在,表明接种PRRS活疫苗随着时间的推移抗原分布呈下降趋势。而强毒抗原分布以脾脏最多,依次是肾脏、肺脏、淋巴结、肝脏、心脏,接种后第14d仍能在各脏器检到PRRS病毒抗原。病理组织学检测结果表明,活疫苗产生以下颌淋巴结、脾脏增生为特征的免疫应答,组织损伤轻微,对肺的病变较少,且仔猪生长良好。强毒则引起以大面积的肺泡隔增宽为特点的间质性肺炎和微循环障碍的病理变化,淋巴小结、脾脏滤泡发生崩解与周围界限不清,个别淋巴细胞核浓缩,组织损伤严重。本试验表明弱毒疫苗对仔猪是安全的。

关键词：猪繁殖-呼吸综合征活疫苗安全性

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利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

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生物工程学报 2006年第5期22卷 720-726页

作者：刘明张云刘春国潘蔚绮刘超男杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室东北农业大学生命技术学院哈尔滨150030

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段，近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因，分别构建了8个基因的转录与表达载体，利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源... 详细信息

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段，近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因，分别构建了8个基因的转录与表达载体，利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸（R-R-R-K-K）基因缺失与修饰，从而消除了病毒基因的毒力相关序列，拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性，病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高，分别为1：2048和1：512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4～5周即可诱导产生高效价的HI抗体，鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96还是近期分离的A／Goose／HLJ／QFY／04都能够产生完全的免疫保护作用，免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。

关键词：禽流感病毒反向遗传学高产株疫苗

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禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

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微生物学报 2009年第10期49卷 1380-1384页

作者：高立祁小乐高宏雷高玉龙秦立廷孙芬芬张云王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体... 详细信息

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋白表达并鉴定。用纯化的gp90蛋白免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆血清。用间接免疫荧光试验检测该血清的特异性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)滴定其效价。【结果】REV gp90基因在重组大肠杆菌中正确表达,免疫小鼠后获得的抗血清可与重组杆状病毒表达的gp90蛋白特异性反应,ELISA效价达到1∶12800,该研究为开展REV诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90蛋白原核表达纯化多克隆抗体

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猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析

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病毒学报 2007年第5期23卷 389-393页

作者：彭伍平夏照和侯强李娜孙元童光志仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基... 详细信息

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因置于蜂素信号肽序列下游,使其在Sf9细胞内表达重组Shimen-E2和HCLV-E2蛋白。结果显示,重组E2蛋白以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,但二者分子量存在差异。用endo H和PNGase F对纯化后的重组E2蛋白进行去糖基化处理后,二者分子量大小变成一致,证实石门强毒株和兔化弱毒株E2蛋白分子量大小的差异可能是由于糖基化程度的差异所致。对986N糖基化位点进行定点突变后发现,突变后的Shimen-E2与野生型HCLV-E2分子量大小一致,而突变后的HCLV-E2与野生型Shimen-E2分子量大小一致,表明Shimen-E2和HCLV-E2分子量大小的差异的确是由于986N糖基化位点的差异引起的。

关键词：猪瘟病毒 E2囊膜糖蛋白糖基化位点杆状病毒表达系统蜂素信号肽

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猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

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微生物学报 2011年第5期51卷 643-647页

作者：吕茂杰陈建飞时洪艳陈小金范秀萍申识川冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B2... 详细信息

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核磷蛋白B23.1 共定位

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鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

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微生物学报 2008年第12期48卷 1666-1670页

作者：秦立廷祁小乐高玉龙高宏雷步志高王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtAΔVP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtAΔVP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5 感染性克隆重组病毒

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H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

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生物工程学报 2009年第11期25卷 1658-1663页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室侬业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;... 详细信息

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。

关键词：禽流感病毒反转录聚合酶链反应 H7N1 亚型鉴别

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一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第1期36卷 65-71页

作者：刘春国刘明张云刘大飞潘蔚绮孙恩成杜金玲李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感中心及国家禽流感参考实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病实验室哈尔滨150001 中国科学院广州生物医药与健康研究院广州510663 黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 东北农业大学动物医学院哈尔滨150030

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连... 详细信息

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%.进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来.

关键词：鹅禽流感病毒 H5N2亚型致病性序列分析

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鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的目的基因点突变对其免疫原性的影响

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病毒学报 1999年第3期15卷 249-251页

作者：江国托刘思国步志高康丽娟卢景良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）中国流行株（ＨＤ）的主要免疫原纤突蛋白Ｓ１基因（Ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ），将其插入载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ ... 详细信息

反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）中国流行株（ＨＤ）的主要免疫原纤突蛋白Ｓ１基因（Ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ），将其插入载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ位点，在大肠杆菌中实现目的基因的分子克隆。经克隆化Ｓ１基因的限制性酶切片段多态性（ＲＦＬＰ）分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交之后，双脱氧链终止法测定其５′端高变区核苷酸序列，并以此与ＧｅｎｅＢａｎｋ中的参考毒株Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ４１相应序列作比较，分析其同源性。在此基础上，分别以此两毒株抗原研制灭活疫苗，交叉免疫攻毒。结果表明，从Ｓ１基因５′端高变区的起始密码子ＡＴＧ至第３５０位，两毒株仅在起始密码子后第１３１位存在一个碱基的点突变，由Ｍ４１的Ｃ突变为ＨＤ株的Ｇ，即Ｓ１蛋白上的第４１个氨基酸由Ｍ４１的Ａｌａ突变为ＨＤ株的Ｇｌｙ，二者核苷酸同源率为９９７％，氨基酸同源率为９９１％。两毒株灭活抗原疫苗免疫后的交叉攻毒试验表明，Ｍ４１毒株疫苗对ＨＤ株的保护率为７５％，而ＨＤ株疫苗对Ｍ４１株的保护率只有６５％。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒免疫原基因点突变

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