检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2021年第6期43卷 651-657页

作者：刘桐潘巧谨瑾曾金红李媛徐青元辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为筛选并鉴定免疫反应原性良好的牛支原体(***)蛋白,本研究提取*** TJ株脂质相关膜蛋白(LAMPs),通过AKTA分子筛筛选,将*** LAMPs分为5组,经dot blot试验鉴定各组LAMPs的免疫反应原性,并经蛋白质谱分析其蛋白组分。结果显示,5组LAMPs中有... 详细信息

为筛选并鉴定免疫反应原性良好的牛支原体(***)蛋白,本研究提取*** TJ株脂质相关膜蛋白(LAMPs),通过AKTA分子筛筛选,将*** LAMPs分为5组,经dot blot试验鉴定各组LAMPs的免疫反应原性,并经蛋白质谱分析其蛋白组分。结果显示,5组LAMPs中有1组膜蛋白反应原性较好,且结合蛋白匹配度得分的排名顺序和基因注释,选定P48、DnaK和L-LDH为候选蛋白。将该3种蛋白经原核表达、纯化及western blot检测其反应原性;并进一步分别以该3种重组蛋白为包被抗原,采用ELISA方法(rP48-ELISA、rDnaK-ELISA、rL-LDH-ELISA)检测并利用Graphpad prism 8软件分析并计算该3种方法的特异性、敏感性及其与牛鼻支原体、丝状支原体丝状亚种SC型、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清的交叉反应性。Western blot结果显示,3种重组蛋白均能与***阳性血清反应,反应原性较好;ELISA结果显示,rP48-ELISA、rDnaK-ELISA、rL-LDH-ELISA方法的特异性分别为96%、94%和98%,敏感性分别为98%、92%和94%。交叉反应性试验结果显示,*** rDnaK和rL-LDH均能与牛鼻支原体阳性血清发生交叉反应,而*** rP48与牛其他临床常见呼吸道病原阳性血清均无交叉反应,表明其具有作为检测*** ELISA方法候选包被抗原的潜力。本研究为进一步筛选***亚单位疫苗抗原及快速诊断方法的候选抗原奠定实验基础。

关键词：牛支原体膜蛋白分子筛免疫反应原性

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宿主分子Tyro3对猪瘟病毒复制的影响及其与E2蛋白相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2021年第11期43卷 1184-1191页

作者：屈亮郑光来于少雄仇华吉李素中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究室前期研究发现受体酪氨酸激酶家族(TAM)成员Mertk为猪瘟病毒(CSFV)的侵入因子。为研究TAM受体家族另外两个成员Tyro3及Axl对CSFV复制的影响,本研究设计并合成了针对Tyro3、Mertk、Axl的siRNA(siTyro3、siMertk、siAxl)和一条无关... 详细信息

本研究室前期研究发现受体酪氨酸激酶家族(TAM)成员Mertk为猪瘟病毒(CSFV)的侵入因子。为研究TAM受体家族另外两个成员Tyro3及Axl对CSFV复制的影响,本研究设计并合成了针对Tyro3、Mertk、Axl的siRNA(siTyro3、siMertk、siAxl)和一条无关siRNA(siNC),将这3种siRNA分别转染PK-15细胞,24 h后以MOI 0.01感染CSFV-SM,48 h后经荧光定量PCR检测各分子的表达以及CSFV基因拷贝数。荧光定量PCR结果显示,3种siRNA分子均能够下调PK-15细胞中Tyro3、Axl和Mertk的转录水平,且下调Mertk、Tyro3后CSFV基因组拷贝数均极显著降低,下调Axl后CSFV基因组拷贝数却无显著变化。因此选择siTyro3转染PK-15细胞后以MOI 0.01CSFV-SM感染PK-15细胞,通过荧光定量PCR及间接免疫荧光试验(IFA)检测siTyro3的转录水平以及CSFV的复制情况,结果显示,Tyro3基因的转录水平、CSFV基因组拷贝数及病毒滴度均显著降低,表明下调Tyro3的表达能够抑制CSFV的复制。按常规方法包装制备Tyro3慢病毒Lenti-Tyro3-HA,将其转导PK-15细胞,传10代后每代均经荧光显微镜观察,并将第10代转导细胞分别经荧光定量PCR和western blot鉴定。结果可见转导的细胞每代均发出绿色荧光,荧光定量PCR和western blot结果显示,第10代转导细胞中Tyro3基因的转录水平极显著上升,且可检测到Tyro3的特异性条带。表明获得了稳定表达Tyro3蛋白的PK-15细胞系PK-Tyro3-HA。将CSFV-SM分别以MOI 1和0.1感染PK-Tyro3-HA细胞系后经荧光定量PCR检测,结果显示CSFV基因组拷贝数分别升高了1.5倍(MOI 1)和2.3倍(MOI 0.1),表明过表达Tyro3后能够促进细胞中CSFV的复制。将不同剂量的兔源Tyro3多克隆抗体(pAb)与PK-15细胞共孵育,封闭PK-15细胞表面Tyro3表位后感染rCSFV-Rluc,经海肾荧光素酶检测,结果显示,20μg/mL和40μg/mL的Tyro3 pAb孵育细胞后再感染rCSFV-Rluc组的海肾荧光素酶活性显著降低,表明Tyro3 pAb能够抑制CSFV的复制。将pCAGGS-Tyro3-HA分别与pCAGGS-E2-Flag、pCAGGS-Erns-Flag共转染HEK293T细胞48 h后,进行免疫共沉淀试验,结果显示Tyro3与CSFV E2囊膜糖蛋白存在相互作用。综上,本研究首次证实Tyro3通过与CSFV E2囊膜糖蛋白的相互作用促进CSFV在PK-15细胞中的复制,为进一步揭示CSFV与宿主细胞的相互作用提供参考依据。

关键词： Tyro3 TAM受体猪瘟病毒

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基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

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中国兽医科学 2021年第4期51卷 475-482页

作者：陈林娜孙军峰李乐师乾凯邸涛刘添仪赵冉张春玮韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-opti... 详细信息

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF。通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果显示,质粒pCAG-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结构。将质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞LMH中,通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成功表达。将质粒p CAG-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞,表达并纯化获得重组蛋白roptiF。SDS-PAGE电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示,表达的roptiF蛋白能够与NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染色电子显微镜观察roptiF蛋白结构,结果显示,roptiF蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因Ⅶ型NDV F蛋白,并且该蛋白能够与抗NDV的血清反应,本研究结果为研制新型NDV疫苗奠定了基础。

关键词：新城疫病毒基因Ⅶ型 F蛋白融合前构象

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伪狂犬病病毒HLJ-2013株gB基因及蛋白特性的初步分析

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中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 357-362页

作者：朱冰王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

gB蛋白是介导猪伪狂犬病病毒(PRV)侵入宿主细胞的关键因子之一,同时也是重要的病毒抗原蛋白。为研究PRV分离株HLJ-2013 gB蛋白与其它参考株的差异性,本研究将HLJ-2013株与GenBank中的80条PRV参考株分别进行gB基因序列及推导氨基酸序列... 详细信息

gB蛋白是介导猪伪狂犬病病毒(PRV)侵入宿主细胞的关键因子之一,同时也是重要的病毒抗原蛋白。为研究PRV分离株HLJ-2013 gB蛋白与其它参考株的差异性,本研究将HLJ-2013株与GenBank中的80条PRV参考株分别进行gB基因序列及推导氨基酸序列的比对,并分析其与参考株gB氨基酸位点的差异;基于最大似然法构建了该基因及推导的氨基酸序列的系统发育树;利用间接免疫荧光试验初步比较了HLJ-2013株与PRV SC株gB抗原性的差异。结果显示,基于gB核苷酸序列及氨基酸序列构建的进化树显示HLJ-2013株处于一个独立于我国分离株的单独分支上,表明其起源可能同国内病毒株不同;与参考株相比,其氨基酸序列中存在27个氨基酸差异位点,并有一个独特的插入基序S75P76G77;免疫荧光鉴定结果显示,PRV SC株gB的一株单克隆抗体不与HLJ-2013株病毒发生特异性结合反应,提示两株病毒gB蛋白的抗原性可能存在差异。本研究初步表明HLJ-2013株的gB和其它病毒株的gB存在遗传及生物学特性上的明显差异,提示HLJ-2013类病毒的流行可能会给我国猪伪狂犬病的防控带来潜在威胁。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gB蛋白氨基酸差异免疫荧光

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马泰勒虫和弩巴贝斯虫双重荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1282-1286,1292页

作者：陈克伟胡哲郭奎刘荻萩戚亭郭巍杨光璞杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(***)和泰勒虫属的马泰勒虫(***)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中***和*** 18S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体... 详细信息

马梨形虫病(EP)是由巴贝斯虫属的驽巴贝斯虫(***)和泰勒虫属的马泰勒虫(***)感染引起的蜱传马属动物疾病。为建立EP两种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中***和*** 18S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了能够同时检测***和***的双重荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1),马疱疹病毒Ⅳ型(EHV-4),马流产沙门氏菌(*** equi),马链球菌(***),马传染性贫血病毒(EIAV)均无交叉反应,特异性强。敏感性试验结果显示,该方法对***和***的质粒标准品的检测下限均为100拷贝/μL,敏感性高;将***和***的质粒标准品10倍倍比稀释为1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(4)拷贝/μL共5个稀释度,进行组内、组间重复性试验,结果显示该方法的组内、组间变异系数均小于5%,重复性好。利用本实验建立的方法对2019年我国北方西部地区200份马属动物全血样品进行检测,结果显示***的阳性率为47%(94/200),***的阳性率为2.5%(5/200),其中***和***混合感染率为1%(2/200),该方法与套式PCR的符合率为97.5%,且该方法具有耗时较短、易操作等特点。本研究首次建立的EP双重荧光定量PCR检测方法对***和***的鉴别检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要的意义。

关键词：马梨形虫马泰勒虫驽巴贝斯虫双重荧光定量PCR

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质谱筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白及其GO分析

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中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 351-356页

作者：倪子欣黄海翔王金良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白,本研究根据H7亚型流感病毒AH1株与H5亚型流感病毒FJ1160株的HA基因序列设计引物,分别PCR扩增两株流感病毒的HA基因,连接至pCAGGS载体,分别构建了H5、H7亚型流感病毒模式病毒株的HA... 详细信息

为了筛选与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白互作的宿主膜蛋白,本研究根据H7亚型流感病毒AH1株与H5亚型流感病毒FJ1160株的HA基因序列设计引物,分别PCR扩增两株流感病毒的HA基因,连接至pCAGGS载体,分别构建了H5、H7亚型流感病毒模式病毒株的HA蛋白真核表达质粒pCAGGS-HA-AH1与pCAGGS-HAFJ1660。将pCAGGS-HA-AH1、pCAGGS-HA-FJ1660分别转染HEK-293T细胞,经培养后提取细胞膜蛋白,利用免疫沉淀(IP)试验筛选与HA蛋白互作的宿主膜蛋白。质谱(shotgun)分析结果显示,有35种宿主膜蛋白同时与H5、H7亚型流感病毒HA蛋白存在相互作用。进一步进行基因本体论(GO)分析,结果显示这35个候选膜蛋白主要作为细胞膜及细胞器膜的组分与其他蛋白或离子结合,以介导生物调控及代谢等过程。为了验证筛选结果的可靠性,利用qPCR对代表性基因ATPAP2、DYNLL1、RAB7A进行检测,结果显示代表性基因ATPAP2、DYNLL1、RAB7A在293T细胞中均有表达,与预测相符。本研究首次筛选得到与两种亚型流感病毒HA蛋白同时存在相互作用的宿主膜蛋白,为进一步对宿主蛋白与流感病毒HA蛋白相互作用机制的研究提供基础数据。

关键词： HA蛋白膜蛋白蛋白质全谱分析 GO分析

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SS-HPS-APP三联亚单位疫苗对小鼠保护效果的评价

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 978-984页

作者：龚俊栾慧栾天赵谦乔宏李刚刘思国王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为评价猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗(下称三联苗)对小鼠的保护效果,本研究将猪链球菌(SS)保护性抗原EF和猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)保护性抗原OMP、ApxI、ApxII序列分别克隆至pET-28a和pCold-sumo载体,再转... 详细信息

为评价猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗(下称三联苗)对小鼠的保护效果,本研究将猪链球菌(SS)保护性抗原EF和猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)保护性抗原OMP、ApxI、ApxII序列分别克隆至pET-28a和pCold-sumo载体,再转化至*** BL21(DE3)中构建重组菌,经过诱导表达纯化获得重组蛋白r EF、rOMP、rApxI和rApxII。利用本研究室前期构建的pET-28a-sly/BL21、pET-28a-mrp/BL21、pET-28aoppa/BL21、pET-28a-oppa2/BL21、pET-28a-afua/BL21、pET-22b-cdtb/BL216株重组表达菌株,表达纯化SS的rSLY、rMRP和副猪嗜血杆菌(HPS)的r OPPA、rOPPA2、rAfuA、rCdtB。将上述重组蛋白等量混匀,使每一剂疫苗中各蛋白的含量均为20μg,再与ISA 201佐剂乳化制成三联苗。将血清2型SS(SS2)464株和SS9 GZ2株按照不同比例稀释后感染C57小鼠;将血清5型HPS(HPS5)HN10株、HPS13 ZD12株、血清5型APP(APP5)MD株和APP7 S-8株按照不同比例稀释后感染BALB/c小鼠,统计上述6个菌株对小鼠的最小致死剂量(MLD)。将20只C57小鼠和40只BALB/c小鼠均分成2组(每组含10只C57小鼠和20只BALB/c小鼠),间隔14 d分别皮下免疫2次300μL PBS+ISA 201佐剂和三联苗。二免后14 d采集小鼠血清,通过间接ELISA检测各组小鼠的EF、MRP、SLY、OPPA、OPPA2、CdtB、AfuA、OMP、ApxI和ApxII的抗体水平。首免后28 d,将C57小鼠再按照免疫组别平均分为2组,分别以MLD的SS2和SS9攻菌;同理,将BALB/c小鼠再平均分为4组,分别以MLD的HPS5、HPS13、APP5和APP7攻菌。结果显示:SS2和SS9对C57小鼠的MLD均为5×10^(7)cfu/只,HPS5、HPS13、APP5和APP7对BALB/c小鼠的MLD分别为1.5×10^(8)cfu/只、5×10^(7)cfu/只、1.5×10^(8)cfu/只和7.5×10^(8)cfu/只。与免疫前相比,二免后14 d实验组小鼠体内对EF、SLY、MRP、OPPA、OPPA2、CdtB、AfuA、OMP、ApxI和ApxII的抗体水平显著升高(p<0.0001),对照组小鼠体内对10种抗原的抗体水平均无差异;实验组与对照组二免后抗体水平差异显著(p<0.0001)。攻菌实验中,对照组小鼠在观察期内全部死亡,攻菌SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7的实验组小鼠存活率分别为100%(5/5)、80%(4/5)、60%(3/5)、80%(4/5),80%(4/5),100%(5/5),对照组和实验组的存活率有显著差异(p<0.05)。以上结果表明该三联苗对SS2、SS9、HPS5、HPS13、APP5和APP7攻击的小鼠能够提供良好的交叉保护性。本研究首次系统研究并证实了该三联苗的免疫保护结果较好,为其进一步研究及应用提供了实验依据。

关键词：猪链球菌病副猪嗜血杆菌病猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗小鼠免疫效力评价

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布鲁氏菌分泌系统及其底物蛋白的研究进展

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 1019-1024页

作者：焉鑫李干武胡森蔡文通步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

布鲁氏菌是革兰氏阴性胞内寄生菌,属于α变形菌门,根瘤菌目,布鲁氏菌科,布鲁氏菌属(Brucella spp.)。布鲁氏菌可以感染人、家畜及野生动物引发布鲁氏菌病,不仅给养殖业带来严重的经济损失,还有引发严重公共卫生问题的风险。

关键词：布鲁氏菌感染过程基因组胞内存活分泌系统宿主蛋白底物蛋白

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鸭坦布苏病毒E蛋白具有独特交叉反应性中和表位的鉴定

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中国兽医学报 2021年第1期41卷 26-32页

作者：林委卫陈雪明李晨曦白小飞刘明张云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位^(227)GSSAGTWQN^(235)。Western blot显示,残基^(231)G或^(233)W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明^(231)G或^(233)W是抗体1G2识别的... 详细信息

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位^(227)GSSAGTWQN^(235)。Western blot显示,残基^(231)G或^(233)W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明^(231)G或^(233)W是抗体1G2识别的关键氨基酸位点。通过免疫荧光分析(IFA)显示,MAb 1G2与JEV、WNV和ZIKV的E蛋白发生交叉反应,表明该表位是黄病毒的交叉反应性表位。蛋白质和病毒模型显示,表位定位于成熟病毒粒子可接近的表面,在E蛋白结构域Ⅱ的hi环中。本研究首次证明,中和抗体1G2靶向交叉反应表位定位在E蛋白结构域Ⅱ的hi环,该表位的鉴定有助于提高对黄病毒血清诊断中存在交叉反应问题的认识和理解。

关键词：黄病毒鸭坦布苏病毒中和抗体交叉反应性交叉表位

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基于SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系研究SYNJ2BP对EIAV复制的影响

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1258-1262,1281页

作者：王欣慧段盈伊陈克伟王雪峰那雷杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为分析突触小泡磷酸酶2结合蛋白(SYNJ2BP)对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究设计了2条靶向SYNJ2BP基因外显子的特异性sgRNA,将sgRNA插入plenti-CRISPRv2GFP载体获得重组质粒pSYNsgRNA1和pSYN-sgRNA2,将这2个重组质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪分选获得单克隆细胞株,测序结果显示SYNJ2BP基因产生插入突变,经western blot确认已敲除SYNJ2BP基因并稳定遗传,表明获得了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系。将EIAV感染性克隆质粒CMV3-8分别转染SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系与野生型细胞,经western blot证实与野生型细胞相比敲除SYNJ2BP抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,灰度值显示囊膜蛋白表达量降低50%。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系,并发现SYNJ2BP基因敲除后抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,本研究为进一步分析SYNJ2BP调节EIAV复制的分子机制提供了参考依据。

关键词： CRISPR/Cas9 马传染性贫血病毒 SYNJ2BP HEK293T

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