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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会

作者：王云峰孙永科田占成智海东刘胜旺王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

传染性支气管炎(IB)是鸡的主要呼吸道疾病之一,给养鸡业造成了巨大的损失。弱毒活疫苗和灭活油佐剂疫苗的应用对该病的控制发挥了十分重要的作用,但随着养鸡规模的日益扩大,病毒变异株和引起不同病变类型和组织嗜性的毒株不断出现,危害... 详细信息

传染性支气管炎(IB)是鸡的主要呼吸道疾病之一,给养鸡业造成了巨大的损失。弱毒活疫苗和灭活油佐剂疫苗的应用对该病的控制发挥了十分重要的作用,但随着养鸡规模的日益扩大,病毒变异株和引起不同病变类型和组织嗜性的毒株不断出现,危害也更为严重,给该病的防制工作带来了重重困难,现有的疫苗研究进度已经难以满足兽医临床的需要。分子生物学技术的出现及其普及为这类危害大、血清型众多的疾病的控制带来了契机,其中禽痘病毒载体疫苗的研究就是现代分子生物学技术在动物疾病控制方面应用的典范。为此,本室构建了能够表达传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒,将其免疫SPF鸡,观察其对免疫鸡的免疫保护作用,同时考察重组鸡Ⅱ型干扰素对活疫苗免疫效果的影响。将80只4周龄的SPF鸡分平均为5组,每组16只。分别接种亲本鸡痘病毒(S-FPV-017接种组)、共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因重组鸡痘病毒(rFPV—IFN—Ⅱ—S1接种组)、表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒(rFPV—IBVS1接种组,所有禽痘病毒免疫组接种途径均为翅皮下无血管处接种,接种剂量为5×106PFU)、传染性支气管炎弱毒疫苗接种组(IB弱毒苗接种组),并设立非免疫鸡为对照。疫苗和重组鸡痘病毒接种后每周采血,分离血清,采用间接ELISA方法测定抗传染性支气管炎病毒抗体效价,并于疫苗和重组鸡痘病毒接种后的28 d,以103 EID50的IBV XJ3强毒株进行点眼滴鼻攻击,从攻毒后第二天观察记录发病和死亡情况。结果表明,接种后7 d开始出现抗体反应,接种后21 d达到峰值,但各组之间的抗体水平略有差异,弱毒疫苗的抗体水平最高,接种后21 d的血清平均OD值为0.32,其次是rFPV—IBVS1接种组,最低的是rFPV—IFN—Ⅱ-S1接种组,接种后21 d的血清平均OD值仅为0.15,但要高于S—FPV—017接种组和非免疫对照组(血清平均OD值低于0.1)。在传染性支气管炎强毒攻击后,rFPV—IFN—Ⅱ—S1提供的保护力最好,有15/16的免疫鸡能够获得保护,其次是rFPV—IBVS1(保护率12/16)和IB弱毒苗(保护率13/16)。攻毒后的病毒分离、间接免疫荧光检测和PCR检测结果表明:rFPV—IFN—Ⅱ—S1接种组在第8天就为病毒阴性,rFPV—IBVS1接种组和IB弱毒苗免疫组在第10 d为病毒阴性,而S—FPV-017和对照组在第12 d才全部为病毒阴性,非免疫对照组则可在强毒攻击后的20 d仍能检测到IB病毒的存在。在对攻毒后肝、脾、肾、支气管和肺的组织学观察表明,随着时间的推移,各组的病变程度呈下降趋势,但是免疫组和非免疫组织间的差异比较显著。在攻毒后第7 d,S—FPV-017免疫组和空白对照组鸡的病变非常严重,空白对照组病变持续了至少20d,S—FPV-017免疫组在攻毒后的16 d肾脏和气管仍有病变;其它免疫组病变较轻,rFPV—IBVS1和IB弱毒苗免疫组病变持续到攻毒后的13d,rFPV—IFN—Ⅱ—S1免疫组病变轻微,仅能在攻毒后的第10d时观察到病变。综合以上研究结果,表达传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒、共表达鸡IFN—Ⅱ和IBV S1基因的重组鸡痘病毒均能有效保护免疫鸡免受IBV的攻击,减轻疫苗接种的副反应,有望被开发为抗IB基因工程疫苗,为控制IBV的发生和流行提供新手段

关键词：重组鸡痘病毒 IFN 鸡传染性支气管炎病毒免疫效力

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表达传染性支气管炎病毒S1基因重组禽痘病毒的构建

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组禽痘病毒的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会

作者：田占成孙永科王云峰智海东刘胜旺王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681-IBVS1。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组,产生表达鸡IBV... 详细信息

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681-IBVS1。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组,产生表达鸡IBV Sl蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有x-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明,获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传,间接免疫荧光和Western-blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90 ku的具有免疫学活性的IBVS1糖蛋白。

关键词：传染性支气管炎病毒重组鸡痘病毒 Sl基因

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以小鼠为模型评价重组伪狂犬病病毒rPRV-HA的免疫效力

以小鼠为模型评价重组伪狂犬病病毒rPRV-HA的免疫效力

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第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会

以小鼠为动物模型,对我们此前构建的表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每只105.0 TCID50 rPRV-HA的剂量通过滴鼻接种8周龄雌性BALB/c小鼠(n=60),同时,设Bartha-K61免疫对照... 详细信息

以小鼠为动物模型,对我们此前构建的表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每只105.0 TCID50 rPRV-HA的剂量通过滴鼻接种8周龄雌性BALB/c小鼠(n=60),同时,设Bartha-K61免疫对照组(n=60)、非免疫攻毒对照组(n=20)和非免疫不攻毒对照组(n=10)。于免疫后不同时间分别从rPRV-HA免疫组和Bartha-K61免疫对照组随机剖杀一定数量的小鼠,其余小鼠于免疫后28d用105.0 TCID50同亚型SIV进行强毒攻击。攻毒后第4、7、14d,分别剖杀小鼠,进行免疫组织化学、病毒分离、血清学和病理组织学检测。结果表明,重组病毒主要分布于肺脏;免疫后14d起,从rPRV-HA免疫组及Bartha-K61免疫对照组均可检测到针对PRV的荧光抗体;从rPRV-HA免疫组可以检测到针对SIV的荧光抗体和血凝抑制抗体,而各对照组均呈阴性。攻毒后从rPRV-HA免疫组小鼠未分离到攻击病毒,血凝抑制抗体显著升高,病理变化比对照组显著轻微,表明rPRV-HA免疫小鼠可以抵抗同亚型SIV的攻击,可以作为rPRV-HA免疫效力评价模型。

关键词：伪狂犬病病毒 H3N2亚型猪流感病毒重组病毒小鼠模型免疫效力

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鹅细小病毒分离株HG5/82的分子特征分析

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中国病毒学 2005年第1期20卷 28-32页

作者：孔宪刚李桂霞刘胜旺冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应... 详细信息

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较。结果表明:HG5/82 株非结构蛋白(Non structure, NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸。HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸。序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础。结构基因 VP3 间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性。HG5/82 与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性。

关键词：鹅细小病毒 ns基因 vp基因分子特征

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猪繁殖与呼吸道综合征疫苗研究进展

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兽药市场指南 2005年第11期 11-12页

作者：童光志田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

一、猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与概述猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）于1987年首先发生于美闰．主要表现为妊娠母猪发生早产、流产,产死胎、弱仔和术乃伊胎，仔绪和育肥猪发生呼吸道疾病，... 详细信息

一、猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与概述猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）于1987年首先发生于美闰．主要表现为妊娠母猪发生早产、流产,产死胎、弱仔和术乃伊胎，仔绪和育肥猪发生呼吸道疾病，死亡率升高，饲料报酬牢降低该病传播速度极快，传染性强，观已遍及全球，虽被世界动物卫生组织列为B类传染病，但其危害不亚于A类传染病对养绪业的危害。陔病病原为诸繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）．1991年在荷兰首次分离到，以后在美国、加拿大、中同及日本陆续分离到。目前根据基因同源性和血清学差异将该病病原分为美洲型和欧洲型，目前在我同流行的主要是美洲型毒株，至今在我国还未有分离出欧洲型毒株的报道。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征呼吸道综合征 syndrome 世界动物卫生组织呼吸综合征病毒疫苗呼吸道疾病基因同源性妊娠母猪

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鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

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中国病毒学 2005年第4期20卷 383-387页

作者：侯秋莲王静刘胜旺孔宪刚韩宗玺冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收... 详细信息

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp25’端969bp片段的原核表达载体。经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体。Westernblot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性。

关键词：鹅细小病毒 vp2基因克隆表达多克隆抗体

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伪狂犬病病毒基因缺失及活载体疫苗研究进展

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动物医学进展 2005年第3期26卷 19-22页

作者：周国辉仇华吉田志军童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病每年给养猪业造成的损失达数十亿美元,目前对该病主要是以疫苗防制为主。随着基因工程技术的不断更新和发展,研制更加安... 详细信息

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病每年给养猪业造成的损失达数十亿美元,目前对该病主要是以疫苗防制为主。随着基因工程技术的不断更新和发展,研制更加安全、有效的基因工程疫苗对该病的防治将会有重要的意义。文章对伪狂犬病基因缺失疫苗及活载体疫苗的研究进行了综述。

关键词：伪狂犬病病毒活载体疫苗基因缺失疫苗种畜基因工程疫苗防制脑脊髓炎主要症状研究进展发热

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会

将猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白编码基因的信号肽序列删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达的重组融合蛋白rtGP5大小约42 kDa,Westernblot分析证实,重组蛋白能被PRRSV... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白编码基因的信号肽序列删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达的重组融合蛋白rtGP5大小约42 kDa,Westernblot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtGP5作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,结果获得了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的杂交瘤细胞株。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,15株单克隆抗体均为IgG1型,其轻链均为κ链。本研究获得的单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析GP5蛋白的抗原表位,设计有效的新型疫苗等提供有益帮助。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白单克隆抗体

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抗SARS病毒卵黄及血清抗体检测方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2005年第7期 51-52页

作者：黄鹤付朝阳王志国崔尚金高宏雷王笑梅李赞李景鹏孔宪刚东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

传染性非典型肺炎,世界卫生组织称其为严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS),是21世纪新发现的一种人类传染病,具有很强的传染性和聚集性,临床表现为发热、咳嗽、呼吸窘促.

关键词：抗体检测方法 SARS病毒严重急性呼吸综合征传染性非典型肺炎 Syndrome 血清卵黄世界卫生组织 21世纪临床表现 SAPS 生命安全身体健康控制措施综合防治生物制剂研究进展传染病聚集性经济带病原学疫苗学咳嗽

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鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会

作者：包晓玮王笑梅高宏雷付朝阳张厚双彭志伟中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

本研究以传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5’端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序... 详细信息

本研究以传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5’端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5,,3,端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,,基因组B节段全长共2 843个核苷酸,包括5,、3端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入PMD-18载体,构建成PMD-A、PMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72 h并传代。收获细胞培养物传代后分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果计算蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒 Gx株全长cDNA 感染性分子克隆

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