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全国首届动物生物技术学术研讨会

2002年11月,第一例严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病例在中国广东省佛山市出现。之后,SARS迅速传播至其它国家和地区,导致数千人死亡。基于世界卫生组织(WHO)的协调,在世界范围内由十三个实验室成立了SAR... 详细信息

2002年11月,第一例严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病例在中国广东省佛山市出现。之后,SARS迅速传播至其它国家和地区,导致数千人死亡。基于世界卫生组织(WHO)的协调,在世界范围内由十三个实验室成立了SARS研究网络,在它们的通力合作下,WHO于2003年4月16日宣布SARS的病源是一种新的冠状病毒,为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。SARS-CoV是一种单链正义RNA病毒,有囊膜结构。病毒基因组约29.7Kb,基因组的组织形式与其它冠状病毒相似,有11个开放阅读框,主要结构蛋白有纤突蛋白(S)、囊膜蛋白(M)、小囊膜糖蛋白(E)和核蛋白(N),无HE蛋白。SARS-CoV的基因序列和蛋白的氨基酸序列与其它已知的冠状病毒的同源性很低。SARS-CoV的纤突蛋白(spike protein)是病毒粒子的一种主要结构蛋白。它在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。在本实验中我们通过生物信息学分析并预测了6个纤突蛋白B细胞表位(S1 S2 S3 S4 S5 S6)。利用6个预测的表位我们首先构建了一个多表位嵌合基因,多表位嵌合基因合成后插入原核表达质粒pGEX-6p-1的多克隆位点BamHI与XhoI之间,构建成GST融合表达质粒。重组质粒转化宿主菌BL21后经IPTG诱导后得到了高效表达。Western blot分析结果表明重组融合蛋白可与SARS病人康复血清反应。用重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次加强免疫后,取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。用ELISA方法筛选出了两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3C5株和D3D1。并且分析了两株单克隆抗体的特性。亚型分析表明其中D3C5是IgG2b,D3D1是IgG1。轻链均为kappa链。ELISA分析表明D3C5与SARS-CoV全抗原反应。Western blot分析结果表明单抗D3D1可以特异地识别SARS-CoV中的大小约为150kD的条带。又将6个预测表位分别与GST融合表达。在这6个融合蛋白中GST-S5可以和单克隆抗体D3C5反应,GST-S2可以和单抗D3D1反应。Western blot分析表明两个单抗所识别的表位均为线性表位。两个表位分别位于SARS-CoV纤突蛋白的第447至458氨基酸残基和789至799氨基酸残基。两个表位的其它特性仍虽进一步分析。近来有研究表明SARS-CoV的功能性受体是血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)。并且有报道显示纤突蛋白中的一个193氨基酸残基的片段(318-510AA)可以比纤突蛋白的S1结构域(12-672AA)更能有效地结合ACE2。并且在这个片段中第454氨基酸残基在与受体结合中是不可改变的。我们所鉴定的表位D3D1(447-458)刚好中位于这一结构域中。所以我们的结果可以为进一步分析SARS-CoV纤突蛋白功能以及防治SARS的研究提供基础。

关键词：严重急性呼吸系统综合征(SARS) 纤突蛋白抗原表位基因表达生物信息学单克隆抗体

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SARS-CoV合成表位单克隆抗体的制备

SARS-CoV合成表位单克隆抗体的制备

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中国科协第五届青年学术年会

SARS(severe acute respriatory syndrome)是2002年11月最早发生于我国广东省的一种严重威胁人类健康的传染性疾病,其病原体是一个新的冠状病毒,即SARS-CoV。本研究参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列,利用计算机软件预测并选取了S... 详细信息

SARS(severe acute respriatory syndrome)是2002年11月最早发生于我国广东省的一种严重威胁人类健康的传染性疾病,其病原体是一个新的冠状病毒,即SARS-CoV。本研究参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列,利用计算机软件预测并选取了SARS-冠状病毒纤突蛋白

关键词： SARS-CoV 嵌合蛋白单克隆抗体

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利用噬菌体展示技术鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位

利用噬菌体展示技术鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位

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农业生物化学与分子生物分会第六次学术交流会

作者：安同庆周艳君仇华吉王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础.正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS... 详细信息

抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础.正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRSV引起的,以妊娠母猪的繁殖障碍以及各年龄猪呼吸道症状为特征的一种传染病,广泛流行于世界各国,给养猪业造成了巨大的经济损失.本研究利用噬菌体随机7肽库对我国分离到第一株PRRS病毒CH-1a株的核衣壳(N)蛋白单克隆抗体N3H2进行了3轮筛选,得到了3个模拟表位:“STTPFKK”、“TKHPQFV”和“STGNRLT”.为进一步研究表位结构,本研究构建了PRRSV ORF7基因特异性肽库,利用N3H2进行了3轮筛选,获得3个阳性噬菌体克隆.序列分析表明,这3个克隆都展示有“IQTAFNQGA”9个氨基酸的序列,对应于PRRSV CH-1a株N蛋白的79-87位氨基酸残基(aa 79-87).人工合成这段表位编码序列并进行原核表达,利用单抗N3H2对表达产物进行Western blot分析和ELISA鉴定,均为阳性.由此表明IQTAFNQGA为PRRSVCH-1a株的一个线性B细胞抗原表位,并将其命名为Ep703.通过与GenBank中41株美洲型分离株的N蛋白的序列进行比较,发现Ep703的序列在美洲型毒株中高度保守.Ep703与Meulenberg等(1998)在欧洲株(LV)N蛋白中鉴定的一个构象表位(由aa 51-67与aa 80-90构成)的aa 80-88序列完全相同,而CH-1a株aa 50-66与LV株aa 51-67相比较,存在2个氨基酸的差异.LV株N蛋白含有2个半胱氨酸(C27、C76),而CH-1a株中含有3个半胱氨酸(C27、C76和C96),因此二者的N蛋白在通过二硫键形成高级结构的方式可能不同,导致两种蛋白具有不同的空间结构和抗原性.二级结构分析发现,aa 79-87区域以β折叠为主,这种构型有助于表位的形成.蛋白的三维结构显示,Ep703的9个氨基酸多肽暴露于蛋白的表面.3个模拟表位与表位Ep703的序列“IQTAFNQGA”相比,相同的氨基酸很少,但是各表位氨基酸的极性却有一个共同的特征,即亲水性氨基酸比例较大,疏水性氨基酸比例较少.因此,我们鉴定的表位Ep703是一个在美洲型毒株中保守的线性B细胞抗原表位.

关键词：噬菌体展示抗原表位猪繁殖与呼吸综合征病毒

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SARS冠状病毒S蛋白抗原表位的分析研究

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位的分析研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：华荣虹周艳君王云峰华玉卓童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

SARS-CoV的纤突蛋白(Spike protein)是病毒粒子的一种主要结构蛋白。它在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。在本实验中我们通过生物信息学分析并预测了6个纤突蛋白B细胞表位(S1 S2 S3 S4 S5 S6)。利用6... 详细信息

SARS-CoV的纤突蛋白(Spike protein)是病毒粒子的一种主要结构蛋白。它在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。在本实验中我们通过生物信息学分析并预测了6个纤突蛋白B细胞表位(S1 S2 S3 S4 S5 S6)。利用6个预测的表位我们首先构建了一个多表位嵌合基因,多表位嵌合基因合成后插入原核表达质粒pGEX-6p-1的多克隆位点BamHI与XhoI之间,构建成GST融合表达质粒。重组质粒转化宿主茵BL21后经IPTG诱导后得到了高效表达。Western blot分析结果表明重组融合蛋白可与SARS病人康复血清反应。用重组融合蛋白为抗原制备了一系列单克隆抗体。将6个预测表位分别与GST融合表达。在这6个融合蛋白中GST-S5可以和单克隆抗体D3C5反应,GST-S2可以和单抗D3D1反应。Western blot分析表明两个单抗所识别的表位均为线性表位。两个表位分别位于SARS-CoV纤突蛋白的第447至458氨基酸残基和789至799氨基酸残基。D3D1表位(447-458)正位于S蛋白与受体结合的结构域中。该研究可以为进一步分析SARS-CoV纤突蛋白功能以及防治SARS的研究提供基础。

关键词：严重急性呼吸系统综合征(SARS) 纤突蛋白表位单克隆抗体

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马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建

马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：涂亚斌王柳仇华吉温建新谷守林童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症。EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性。在反转录病毒前病毒基因组... 详细信息

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症。EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性。在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其

关键词：嵌合病毒马传贫感染性分子克隆马传染性贫血体外构建

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禽流感:一种人畜共患病

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生物技术通报 2004年第4期20卷 1-4,9页

作者：王靖飞童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

禽流感 (AvianInfluenza ,AI)是严重危害畜牧业与人类健康的一种传染性疾病。多年来在世界上许多国家和地区都发生过此病 ,危害严重 ,经济损失巨大。禽流感病毒可感染多种动物 ,包括人、猪、马、鲸、海豹和雪貂。禽流感病毒经变异或基... 详细信息

禽流感 (AvianInfluenza ,AI)是严重危害畜牧业与人类健康的一种传染性疾病。多年来在世界上许多国家和地区都发生过此病 ,危害严重 ,经济损失巨大。禽流感病毒可感染多种动物 ,包括人、猪、马、鲸、海豹和雪貂。禽流感病毒经变异或基因重组 ,已具备感染人的能力 ,有可能成为人类新型流感流行的潜在病原。本文对与禽流感病毒相关的流感疫情进行历史性的回顾。

关键词：禽流感人畜共患病抗原变异病毒分子生物学

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猪瘟病毒Erns和E2基因的高效表达与Erns-ELISA鉴别诊断方法的建立

猪瘟病毒Erns和E2基因的高效表达与Erns-ELISA鉴别诊断方法的建立

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农业生物化学与分子生物分会第六次学术交流会

作者：贾洪林仇华吉李国新朱庆虎李娜童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度传染性和致死性疾病。为建立与以猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2为基础的标记疫苗相配套的鉴别诊断试验,本研究克隆了猪瘟病毒石门系强毒株Erns基... 详细信息

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度传染性和致死性疾病。为建立与以猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2为基础的标记疫苗相配套的鉴别诊断试验,本研究克隆了猪瘟病毒石门系强毒株Erns基因和E2基因主要抗原编码区,同时分别将其在大肠杆菌中进行了高效表达,并建立了基于重组蛋白抗原的Erns-ELISA和E2-ELISA诊断方法。设计并合成跨越CSFV Erns基因和E2基因主要抗原编码区序列的特异性引物,采用RT-PCR方法从CSFV石门系强毒株基因组RNA中扩增出0.7kb的完整Erns基因片段,从含有E2基因的重组质粒pcCDST中扩增出0.4kb的部分E2基因片段,分别将其克隆于原核表达载体pPROEXTMHTc和pPROEXTMHTb中,经酶切和PCR鉴定后,再进行序列测定。结果表明,Erns基因编码区核苷酸序列长度为723bp,编码240个氨基酸残基;部分E2基因片段的核苷酸序列长384bp,编码128个氨基酸残基,分别与GenBank中收录的CSFV石门系强毒株(GenBank accession ***092448)对应序列一致。阳性菌经IPTG诱导后获得高效表达,表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,表达的重组Erns融合蛋白和截短的重组E2融合蛋白分子量分别为31ku和19ku左右,分别占菌体总蛋白的27.6%和33.5%。Western blotting分析表明,表达的融合蛋白均具有免疫反应性。将表达的融合蛋白分别进行亲和层析纯化,得到纯度很高的目的蛋白。用纯化的Erns融合蛋白作为包被抗原建立了Erns-ELISA,经优化,抗原最适包被量为0.15μg,血清工作浓度为1:100倍稀释,阳性判定标准为OD490(?)0.3。经敏感性试验、特异性试验、阻断试验和重复性试验表明,本研究建立的Erns-ELISA简便、敏感、特异、稳定。通过对90份血清进行平行盲测,Erns-ELISA与E2-ELISA的符合率高达96.7%,与基于病毒抗原的Dot-ELISA的符合率达77.5%。总之,本研究高效表达了猪瘟病毒Erns与部分E2基因,建立了Erns-ELISA和E2-ELISA,可以作为基于E2蛋白的猪瘟标记疫苗的配套鉴别诊断技术,用于今后的猪瘟扑灭计划。

关键词：猪瘟猪瘟病毒 Erns-ELISA E2-ELISA 鉴别诊断试验

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表达SARS冠状病毒N基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

表达SARS冠状病毒N基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

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全国首届动物生物技术学术研讨会

作者：王红霞孟庆文吴东来孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

经RT-PCR扩增了SARS BJ01株N基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序,全长1268bp。然后亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacHis A的分泌信号下游,筛选到重组转移载体命名为pMelN,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染Sf9... 详细信息

经RT-PCR扩增了SARS BJ01株N基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序,全长1268bp。然后亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacHis A的分泌信号下游,筛选到重组转移载体命名为pMelN,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpMelN。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中。

关键词： SARS冠状病毒 N基因重组杆状病毒

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抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：彭金美童光志王云峰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质... 详细信息

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒:1、pIRES/HA(表达全长的HA基因);2、pIRES/tHA(只表达HA基因的主要抗原表位区):3、pIRES/tHA-NPep(融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的三个CTL表位);4、pIRES/tHA-NPep-IFN-γ,(用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHA-NPep中的neo基因)。分别用这四个重组质粒和空载体质粒pIRESlneo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫三次,间隔为两周,每次每只鸡的剂量为200μg。第三次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4+、CD8+T细胞的变化。结果,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体,攻毒后一周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64-256。流式细胞术检测外周血CD4+、CD8-T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。载体质粒对照组鸡(10只)在攻毒后3-8天内全部死亡,其他各质粒免疫组鸡都获得了部分保护,保护率分别是,pIRES/HA组为54.5%(6/11),pIREStHA组为30%(3/10),pIRESHA1NPep组为36.3%(4/11),pIRESHA1NPep-IFN-γ组为50%(5/10)。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答,并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。

关键词：多表位DNA疫苗禽流感病毒

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禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力

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中国兽医科技 2004年第5期34卷 20-23页

作者：乔传玲李呈军于康震刘志军李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 全国畜牧兽医总站北京100026 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

将表达禽流感病毒 (AIV)H5HA和N1NA基因的重组禽痘病毒 (rFPV HA NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄SPF鸡。结果 ,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡 ,能够诱导其产生... 详细信息

将表达禽流感病毒 (AIV)H5HA和N1NA基因的重组禽痘病毒 (rFPV HA NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄SPF鸡。结果 ,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡 ,能够诱导其产生血凝抑制 (HI)抗体 ;用10 0LD50 的HPAIVA/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)毒株攻击后 ,免疫鸡无一发病和死亡 ,免疫保护率为 10 0 %。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡 ,大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体 ,攻毒后的保护率分别为 83.3%、6 6 .7% ;而小剂量接种则不产生免疫反应 ,保护率为 0。表明rFPV HA NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种 ,才能够诱导机体产生高水平的免疫力。

关键词：禽流感重组禽痘病毒疫苗接种途径剂量免疫效力

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