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中国畜牧兽医学会禽病学分会第12次学术研讨会

作者：姜永萍李呈军张洪波张芳芳步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(哈尔滨) 农业部畜牧兽医总站(北京)

免疫原基因的密码子优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略.不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及... 详细信息

免疫原基因的密码子优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略.不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)<'[GD/1/96(H5N1)]>的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIopiHA,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质料pCIHA和pCIoptiHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的HA基因体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.

关键词： HA基因密码子优化重叠延伸PCR 间接免疫荧光 Western blot检测禽流感病毒 DNA疫苗疫苗免疫保护

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鸡β—actin启动子表达载体pCAGGS显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

鸡β—actin启动子表达载体pCAGGS显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免...

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第12次学术研讨会

作者：姜永萍张洪波李呈军张芳芳步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(哈尔滨) 农业部畜牧兽医总站(北京)

真核表达载体的优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略之一.pCAGGS含鸡β-actin启动子和CMV增强子,是一种高效真核表达载体.将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的HA基因插入pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA,将pCAGGHA和表达GD/1/96(H5N... 详细信息

真核表达载体的优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略之一.pCAGGS含鸡β-actin启动子和CMV增强子,是一种高效真核表达载体.将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)<'[GD/1/96(H5N1)]>的HA基因插入pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA,将pCAGGHA和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白,Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI.为进一步评估不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,DNA疫苗质粒pCIHA及pCAGGHA分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD<,50>的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化.结果,100μg pCAGGHA可形成100﹪的免疫保护,100μg pCIHA可形成50﹪的免疫保护,10μg pCAGGHA可形成对免疫鸡100﹪的免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCAGGHA诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA.试验结果表明,鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果.

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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利用DNA芯片检测并鉴定禽流感病毒亚型

利用DNA芯片检测并鉴定禽流感病毒亚型

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全国首届动物生物技术学术研讨会

作者：王秀荣邓国华于康震乔传玲刘丽玲陈化兰姜永萍中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室

流感病毒是属于正粘病毒科的RNA病毒,只有A型流感病毒可以在自然条件下感染鸟类。A型流感病毒基因组含有8个单股负链RNA病毒节段,从禽类中分离到15个血凝素、9个神经氨酸酶亚型。A型流感病毒感染家禽后根据致病力不同可以分为高致病力... 详细信息

流感病毒是属于正粘病毒科的RNA病毒,只有A型流感病毒可以在自然条件下感染鸟类。A型流感病毒基因组含有8个单股负链RNA病毒节段,从禽类中分离到15个血凝素、9个神经氨酸酶亚型。A型流感病毒感染家禽后根据致病力不同可以分为高致病力和低致病力病毒,高致病力毒株对禽有高度致死力,死亡率可高达100%,这些高致病力毒株均属于H5和H7亚型,但不是所有的H5和H7亚型流感都是高致病力的毒株。低致病力毒株大多数属于H9N2亚型,在全世界范围引起广泛的疾病综合症,H9N2病毒引起的病症比H5和H7禽流感引起的病症要温和得多,主要局限于呼吸道症状,但是在其他疾病病原合并感染或环境因素的协同下,临床症状可能严重得多。我们在基因芯片平台上建立了一种可靠地检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的快速检测技术,实验中使用的毒株为A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/African starling/983/79(H7N1)and A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)。本研究设计的DNA芯片可以用来鉴别禽流感病毒的亚型,通过RT-PCR获得大的500bp的禽流感病毒基因cDNAs片段,克隆,从重组质粒扩增DNA片段,并点到玻璃载体上,制成芯片。在病毒RNA反转录过程中,用Cy5标记做靶cDNAs。靶cDNAs是一个包括禽流感病毒HA、NS和M基因的混合物。依据M、NS基因鉴别型,依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点,杂交信号与预期设想基本一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。

关键词：禽流感基因芯片鉴别亚型

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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株核蛋白基因分子演化的研究

H1N1亚型猪流感病毒中国分离株核蛋白基因分子演化的研究

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家畜传染病学会第六次人畜共患病学术交流会

作者：陈君彦李海燕陈化兰李泽君于康震中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室

本研究对2001年中国华南及东北地区的15株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)分离株的核蛋白(NP)基因进行了序列测定和分析,并绘制了进化树。研究结果表明,15株H1N1亚型SIV的NP基因核甘酸全长为1565bp,共编码498个氨基酸。经同源性比较结果可知,除... 详细信息

本研究对2001年中国华南及东北地区的15株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)分离株的核蛋白(NP)基因进行了序列测定和分析,并绘制了进化树。研究结果表明,15株H1N1亚型SIV的NP基因核甘酸全长为1565bp,共编码498个氨基酸。经同源性比较结果可知,除SW/HLJ/395/01外,其余14株H1N1亚型SIV的NP基因核苷酸序列与参考毒株SW/BJ/94/91保持相对最高的同源性,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96.5-97.4%、97.8-99.0%;并且与类猪人流感病毒WIS/3523/88和NJ/8/76核苷酸序列的同源性也可分别达到95.5-96.5%、92.7-93.7%,推导氨基酸序列的同源性分别为96.8-99.0%、94.6-97.2%,相对较高。但是,SW/HLJ/395/01与类禽型H1N1猪谱系的代表毒株SW/GER/2/81同源性最高,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.9%和99.0%。经进化树分析可见,SW/HLJ/395/01属于类禽H1N1猪谱系,其它14株H1N1亚型SIV的NP基因皆属于古典型H1N1猪谱系。

关键词：猪流感病毒核蛋白 H1N1亚型序列分析分子演化

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抗原基因密码子的优化增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

抗原基因密码子的优化增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

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第六次人畜共患病学术交流会

作者：姜永萍张洪波李呈军张芳芳朱启运邓国华包红梅于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(哈尔滨)

免疫原基因的密码子优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略.鸡与哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中具有相同的密码子编嗜性,但与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR... 详细信息

免疫原基因的密码子优化是提高DNA疫苗免疫保护效果的有效策略.鸡与哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中具有相同的密码子编嗜性,但与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒***疫苗质粒pCIHA和pCIoptiHA分别围染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白,结果密码子优化的HA基因表达水平显著高于野生型HA基因.为进一步评估HA基因密码子优化对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,表达野生型HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA及pCIoptiHA分析以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD<,50>的HPAIV A/Chicken/LN/45/01(H5N1)[LN/45/01(H5N1)]鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化.结果,100μg pCIoptiHA可形成75﹪的免疫保护,100μg pCIHA可形成50﹪的免疫保护;10μg pCIoptiHA可形成对免疫鸡75﹪的部分免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA.试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果.

关键词：禽流感 DNA疫苗免疫保护免疫原基因免疫反应

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禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达

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动物医学进展 2004年第4期25卷 107-110页

作者：张芳芳刘光亮姜永萍陈化兰陈怀涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室甘肃农业大学甘肃兰州730070

为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入... 详细信息

为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。

关键词：禽流感病毒 H5HA基因 H7HA基因基因表达核酸疫苗质粒间接免疫荧光

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表达载体的优化显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

表达载体的优化显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍张洪波李呈军张芳芳步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室

CAGGS含鸡β-actin启动子和CMV增强子,是一种高效真核表达载体。将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA,将pCAGGHA和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白,Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI。为进一步评估不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,DNA疫苗质粒pCIHA及pCAGGHA分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果,100μg pCAGGHA可形成100%的免疫保护,100μg pCIHA可形成50%的免疫保护;10μg pCAGGHA可形成对免疫鸡100%的免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCAGGHA诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA。试验结果表明,鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株神经氨酸酶基因分子演化的研究

H1N1亚型猪流感病毒中国分离株神经氨酸酶基因分子演化的研究

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家畜传染病学会第六次人畜共患病学术交流会

作者：陈君彦李海燕陈化兰杨焕良李泽君于康震毕英佐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室华南农业大学动物科学学院

本研究对2001年中国华南及东北地区的15株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)分离株的神经氨酸酶(NA)基因进行了序列测定和分析,并绘制了进化树。研究结果表明,15株H1N1亚型SIV的NA基因核甘酸全长为1458bp,共编码477个氨基酸。15株H1N1亚型SIV的N... 详细信息

本研究对2001年中国华南及东北地区的15株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)分离株的神经氨酸酶(NA)基因进行了序列测定和分析,并绘制了进化树。研究结果表明,15株H1N1亚型SIV的NA基因核甘酸全长为1458bp,共编码477个氨基酸。15株H1N1亚型SIV的NA蛋白在58、63、68、88、146位都存在糖基化位点;但是,SW/GD/714/01和SW/GD/771/01在50位存在一糖基化位点,为“-NQS-,其余13株H1N1亚型SIV在50位无糖基化位点,却在44位存在“-NHS-”的糖基化位点;而且,SW/GD/714/01、SW/GD/771/01和其余13株H1N1亚型SIV的NA蛋白头部抗原位点,在328、332、334、339、340位的氨基酸不同;但是,15株H1N1亚型SIV在366位的氨基酸均为N,与所有参考毒株在此位的S不同。经同源性比较结果和进化树分析可见,SW/GD/714/01和SW/GD/771/01的NA基因明显属于类禽型H1N1猪谱系,其余13株H1N1亚型SIV的NA基因皆属于古典型H1N1猪谱系。

关键词：猪流感病毒神经氨酸酶 H1N1亚型序列分析分子演化

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用鸡体偏嗜性密码子对H5亚型禽流感病毒HA基因的优化与构建及其DNA疫苗体外表达研究

用鸡体偏嗜性密码子对H5亚型禽流感病毒HA基因的优化与构建及其DN...

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中国畜牧兽医学会2004年学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍李呈军张洪波步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(黑龙江哈尔滨) 农业部畜牧兽医总站(北京)

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/... 详细信息

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA和pCIoptiHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.

关键词： HA基因密码子优化重叠延伸PCR 间接免疫荧光 Western blot检测禽流感病毒 DNA疫苗体外表达

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鸡体偏嗜性密码子优化免疫原基因增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

鸡体偏嗜性密码子优化免疫原基因增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保...

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中国畜牧兽医学会2004年学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(黑龙江哈尔滨) 农业部畜牧兽医总站(北京)

利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA.将pCIoptiHA和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA及pCIHA分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD<,50>的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击.结果,间接免疫荧光法和Western-blot分析表明密码子优化的HA基因表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μg pCIoptiHA可形成75﹪的免疫保护,100μg pCIHA可形成50﹪的免疫保护;10μg pCIoptiHA可形成对免疫鸡75﹪的部分免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA.试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果.

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗免疫保护密码子优化

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