检索结果-内蒙古大学图书馆

中国实验动物学报 2019年第2期27卷 200-207页

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELIS... 详细信息

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于^(297)NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI^(322),对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。

关键词：主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单克隆抗体特异性

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利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

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中国预防兽医学报 2019年第2期41卷 125-130页

作者：刘冉陈福广陈平黄萌萌朱金鲁谢芳孟庆文刘思国刘建华张跃灵新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐8300522 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在*** 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采... 详细信息

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在*** 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化***并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_(tufA-cre)质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建***基因缺失株、研究***致病机制提供了新的选择。

关键词：猪链球菌信息肽诱导 Cre/LoxP系统基因缺失

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马CD63分子的克隆与可溶性表达

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黑龙江畜牧兽医 2019年第23期 65-68,169页

作者：孙金辉胡哲初晓雨郭奎王晓钧崔焕忠吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

CD63是巨噬细胞表面的跨膜蛋白,已经证实其对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)在人巨噬细胞中的复制有重要作用。为了探讨马传染病病毒与巨噬细胞的相互作用,对马巨噬细胞的表面蛋白(CD63)进行体外表达,通过跨膜区分析软件分析CD63蛋白的... 详细信息

CD63是巨噬细胞表面的跨膜蛋白,已经证实其对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)在人巨噬细胞中的复制有重要作用。为了探讨马传染病病毒与巨噬细胞的相互作用,对马巨噬细胞的表面蛋白(CD63)进行体外表达,通过跨膜区分析软件分析CD63蛋白的跨膜结构,利用分子克隆技术构建不同片段大小的重组质粒,并进行原核表达及诱导条件的优化。结果表明:全长CD63在原核系统中不表达,截短CD63蛋白为包涵体表达,当低温诱导时截短CD63可获得可溶性表达,大小约为20 ku。说明成功获得CD63可溶性表达蛋白。

关键词：巨噬细胞 CD63 跨膜蛋白原核表达可溶性表达

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鸡毒支原体GroEL蛋白通过NF-κB信号通路诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究

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中国预防兽医学报 2019年第3期41卷 223-228页

作者：张琳陈莹朱可蒙赵雅芝潘巧郝文君于颖辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋... 详细信息

鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋白,利用激光共聚焦试验、荧光定量PCR和western blot方法分别检测GroEL蛋白的粘附特性、p65入核、磷酸化水平及IL-1β分泌情况。激光共聚焦试验结果显示,GroEL蛋白能够黏附于DF-1细胞表面并刺激DF-1细胞中p65从胞浆转入细胞核;western blot检测显示GroEL蛋白能够激活NF-κB信号通路促进p65磷酸化水平提高;荧光定量PCR检测显示GroEL蛋白能够促进IL-1β释放,当NF-κB信号通路被抑制后,IL-1β的释放显著下降(p<0.01)。本研究结果表明MG GroEL蛋白能够粘附于宿主细胞表面并通过激活NF-κB信号通路诱导宿主细胞IL-1β的释放,从而在炎症反应中发挥作用。本研究为深入研究MG致病机制提供了实验依据。

关键词：鸡毒支原体 GroEL蛋白 IL-1β p65 NF-κB

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胶体金检测试纸卡在检测非洲猪瘟病毒抗体上的应用

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养殖与饲料 2020年第11期19卷 15-18页

作者：张元峰刘锡玲毕路李佳方瑞李乾赵俊龙毕丁仁黄丽步志高翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 武汉观锐生物科技有限公司武汉430070 武汉科维创生物科技有限公司武汉430014

本研究采用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测倍比稀释后的非洲猪瘟病毒标准阳性血清,将标准阳性血清倍比稀释至1∶256时,试纸卡检测线仍呈现清晰的、肉眼可见的红色沉淀线;标准阴性血清、空载体血清及其他无关病毒阳性血清各稀释度均无... 详细信息

本研究采用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测倍比稀释后的非洲猪瘟病毒标准阳性血清,将标准阳性血清倍比稀释至1∶256时,试纸卡检测线仍呈现清晰的、肉眼可见的红色沉淀线;标准阴性血清、空载体血清及其他无关病毒阳性血清各稀释度均无沉淀线。检测已知感染猪血清时,最早感染后第8天即能查出阳性抗体,与ELISA检测结果一致。用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡对230份送检猪血清中的非洲猪瘟抗体进行检测,并与西班牙INGENASA非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒进行比较试验。试验结果显示,阳性符合率为80%,阴性符合率为89.2%,总符合率为84.8%,说明本试验所制备的试纸卡在检测非洲猪瘟病毒抗体的临床应用中特异性强、准确度高,与常规ELISA试剂盒比较,能更快、更便捷地查出猪群中非洲猪瘟病毒抗体阳性猪,更适合于普通实验室及养殖单位现场临床应用。

关键词：非洲猪瘟抗体检测胶体金检测试纸卡病毒抗体

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水貂阿留申病毒VP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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实验动物与比较医学 2020年第4期40卷 289-295页

作者：闫文卓陆涛峰周洁赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 贵州中医药大学实验动物研究所贵阳550025 上海实验动物研究中心上海201203

目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,... 详细信息

目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,绘制标准曲线,并进行特异性、敏感性和稳定性分析。结果建立的标准曲线在1.0×10^2拷贝/μL至1.0×10^8拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数(r^2)大于0.994。该方法检测的灵敏度为10^2拷贝/μL,且与犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒和水貂病毒性肠炎病毒均无明显交叉反应,特异性良好。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于3%,重复性良好。利用该方法对417份临床组织样品进行检测的结果显示,中国部分地区的AMDV阳性率为81.5%。结论本研究建立了一种重复性、特异性和敏感性良好的AMDV荧光定量PCR检测方法,可用于AMDV的临床检测和流行病学调查。

关键词：水貂阿留申病水貂阿留申病毒实时荧光定量PCR VP2 检测方法

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重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫效力研究

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 611-615页

作者：吴姣姣曾显营陈晓涵臧金凯包红梅施建忠邓国华郭兴福刘景利毛胜刚杨帆陈志宇孙项楠路通陈化兰田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司黑龙江哈尔滨150069

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究将该疫苗按照现地免疫程序分别接种10日龄白羽肉鸡和14日龄黄羽肉鸡,疫苗接种前和接种后每周采血,分离血清,检测H5亚型Re-8株和H7... 详细信息

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究将该疫苗按照现地免疫程序分别接种10日龄白羽肉鸡和14日龄黄羽肉鸡,疫苗接种前和接种后每周采血,分离血清,检测H5亚型Re-8株和H7亚型H7-Re1株禽流感病毒(AIV)HI抗体滴度,并在初次免疫后3周和出栏时以鼻腔感染方式分别进行攻毒试验。结果显示,免疫前,所有肉鸡血清中H7亚型H7-Re1株AIV HI抗体滴度均低于1log2,H5亚型Re-8株AIV平均HI抗体滴度分别为5.3log2(白羽肉鸡)和4.1log2(黄羽肉鸡);一次免疫的白羽肉鸡在免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度在6.0log2~6.7log2;2次免疫的黄羽肉鸡在初次免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度均在6.0log2以上。在一次免疫后3周时和出栏时,采用高致病性H5、H7亚型AIV攻毒后,对照组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均全部死亡,免疫组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护。本研究结果表明,重组AIV二价灭活疫苗对商品肉鸡具有良好的免疫效果,为该疫苗的现地应用提供了参考依据。

关键词：禽流感灭活疫苗 H5+H7 商品肉鸡免疫效力

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自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

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病毒学报 2019年第6期35卷 888-894页

作者：刘鑫王斌姚晓雨郑永辉范春玲黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆 163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所‐美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨 150001

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研... 详细信息

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P<0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。

关键词：自噬(Autophagy) 自噬相关基因3(Atg3) 埃博拉病毒(EBOV) 囊膜蛋白(GP)

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PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

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中国农业科学 2018年第17期51卷 3379-3388页

作者：尹馨马树杰李梅邓国华侯玉杰崔鹏飞施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分... 详细信息

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。

关键词： H7N9 PB2 E627V 致病力聚合酶活性

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非洲猪瘟——我国养猪业的重大威胁

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中国农业科学 2018年第21期51卷 4177-4187页

作者：罗玉子孙元王涛仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病,急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血,发病率和病死率可高达100%。世界动物卫生组织... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病,急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血,发病率和病死率可高达100%。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病,是我国重点防范的外来动物疫病之一。ASF在撒哈拉以南的非洲地区、意大利撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行,给疫区国家的养猪业造成巨大的经济损失,并严重冲击畜产品的国际贸易。2018年8月,ASF首次传入我国,随后迅速大范围蔓延,对我国养猪业构成重大威胁,防控形势异常严峻。随着经济全球化发展,ASF呈全球流行态势,持续传入我国的风险极高。鉴于目前无商业化的ASF疫苗,亟需研发可实现现场快速检测的早期诊断技术,做到对疫情早发现、早控制。由于ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制,使得研制有效的疫苗十分困难。目前研制的灭活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗不能提供免疫保护或仅能提供部分保护,而减毒活疫苗和基因缺失疫苗可以诱导完全的同源保护和部分的交叉保护。未来需要深入解析病毒毒力相关基因和免疫保护性相关抗原,并着力研制基因缺失疫苗和弱毒疫苗,解决其安全性、稳定性和免疫效力等难题。本文就ASF的流行病学、诊断技术和疫苗研发等方面的最新研究进展及防控面临的挑战进行综述,并提出防控策略及建议,以期为我国ASF的防控提供参考。

关键词：非洲猪瘟中国流行病学诊断疫苗防控策略

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