检索结果-内蒙古大学图书馆

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

中国动物传染病学报 2019年第5期27卷 14-21页

作者：许曼黄立平邵玉乐夏德利曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑视黄酸诱导基因Ⅰ信号通路 PK-15 猪圆环病毒2型

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USP18分子通过Ⅰ型干扰素通路影响猪瘟病毒复制的研究

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 455-461页

作者：王文静李素王竞晗仇华吉肖书奇西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细... 详细信息

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细胞系及应用特异性小干扰RNA下调表达USP18的方法,采用荧光定量PCR验证USP18对CSFV增殖的影响,结果显示USP18分子能够促进CSFV的复制;通过检测IFN-β、NF-κB及ISRE的启动子活性及I型干扰素(IFN-I)信号通路的下游分子m RNA的转录水平,采用荧光定量PCR和双荧光酶报答试验分析USP18对IFN-I信号通路的影响,结果显示USP18分子抑制IFN-I信号通路。以上结果表明CSFV通过诱导USP18分子的上调表达,抑制了IFN-I途径,从而逃避天然免疫防御,进而促进自身的复制。本研究为明确CSFV与宿主之间的相互作用及CSFV致病机制提供参考依据和奠定基础。

关键词： USP18 猪瘟病毒 Ⅰ型干扰素天然免疫

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正交试验法在优化重组乳酸乳球菌诱导表达中的应用研究

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中国家禽 2019年第5期41卷 25-28页

作者：张园王文骞宋雨心王婷婷刘琳琳崔红玉何高明石河子大学动物科技学院新疆石河子832002 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为提高重组乳酸菌NICE诱导表达系统表达外源蛋白的能力,研究选取Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间这4个主要影响表达的因素,每个因素设置3个水平,设计4因素3水平(43)正交试验。通过优化Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间,从... 详细信息

为提高重组乳酸菌NICE诱导表达系统表达外源蛋白的能力,研究选取Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间这4个主要影响表达的因素,每个因素设置3个水平,设计4因素3水平(43)正交试验。通过优化Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间,从而确定重组乳酸菌表达外源蛋白最佳条件。结果显示:当Nisin的量为1 ng/mL、OD值为0.3、诱导温度为30℃、诱导时间为7 h时,其重组乳酸菌表达外源蛋白的量最高。研究结果为由Nisin控制表达基因系统的重组乳酸乳球菌疫苗开发奠定了基础。

关键词：重组乳酸乳球菌正交试验法诱导表达

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伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 553-559页

作者：王书文吕闯蔡雪辉吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(N... 详细信息

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。

关键词：伪狂犬病病毒 pUL56 高尔基体 Co-IP 蛋白互作

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一株H4N8亚型禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

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中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 1004-1008页

作者：薛振宇崔鹏飞谷文丽韩舒雨张元成邢鑫彭大新邓国华陈化兰扬州大学江苏扬州225009 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

H4亚型禽流感病毒(AIV)不仅可以感染禽类,还可以跨物种感染哺乳动物,其潜在危害不可忽视。为了解本实验室2018年从重庆活禽市场分离到的一株鸭源H4N8亚型AIV[A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)]的生物学特性,本研究对其进行了全基因组... 详细信息

H4亚型禽流感病毒(AIV)不仅可以感染禽类,还可以跨物种感染哺乳动物,其潜在危害不可忽视。为了解本实验室2018年从重庆活禽市场分离到的一株鸭源H4N8亚型AIV[A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)]的生物学特性,本研究对其进行了全基因组测序、遗传进化分析及BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示,血凝素(HA)蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,表明其具有低致病性AIV的分子特征,神经氨酸酶(NA)基因茎部无缺失。遗传演化分析结果显示,NA基因及非结构蛋白(NS)基因与A/Muscovy duck/Vietnam/LBM240/2012(H3N8)的同源关系密切,其余节段的来源均不同,表明该病毒来源广泛,具有遗传多样性。BALB/c小鼠的感染性试验结果显示,该病毒可以在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,表明其具有感染哺乳动物的风险。本研究为H4亚型AIV的遗传进化特征分析提供参考依据。

关键词：禽流感病毒 H4N8 生物学特性

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CRISPR技术在病毒学研究中的应用

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中国动物检疫 2020年第6期37卷 60-67页

作者：高帅李芳李赞王涛赵东明步志高天津大学生命科学学院天津300072 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 国家动物疫病防控高级别生物安全实验室黑龙江哈尔滨150069

近年来,CRISPR/Cas系统凭借其操作简单、靶向精准、效率高等优点,在生物学领域的应用潜力备受关注。通过总结CRISPR技术在抗病毒药物潜在靶点筛选、疫苗开发、病毒核酸快速检测、病毒性疾病临床治疗等领域的应用,阐明了CRISPR/Cas系统... 详细信息

近年来,CRISPR/Cas系统凭借其操作简单、靶向精准、效率高等优点,在生物学领域的应用潜力备受关注。通过总结CRISPR技术在抗病毒药物潜在靶点筛选、疫苗开发、病毒核酸快速检测、病毒性疾病临床治疗等领域的应用,阐明了CRISPR/Cas系统目前面临的挑战及相应的解决措施。作为一种基因编辑技术,CRISPR/Cas系统可以快捷地筛选出多种病毒的潜在药物靶点;可以改造病毒基因组,为研发基因缺失活疫苗做储备;可以快速准确诊断病毒性疾病,也可以为乙肝、艾滋病等病毒性疾病的治疗提供新方向。CRISPR/Cas系统仍存在致癌风险、脱靶效应以及递送系统的安全准确性不足等问题。随着CRISPR技术的不断完善,该技术必将会给病毒性疾病的检测诊断与预防控制带来重大变革。

关键词： CRISPR 病毒疫苗开发核酸检测临床研究

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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

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中国家禽 2019年第11期41卷 12-17页

作者：曾为俊许曼王辉鲁国涛邵玉乐陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株... 详细信息

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

关键词： RIG-I CRISPR/Cas9 MDCK细胞系基因敲除 H9N2亚型流感病毒

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利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

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中国兽医科学 2019年第9期49卷 1128-1135页

作者：邵玉乐许曼王辉曾为俊鲁国涛赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检... 详细信息

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。

关键词： TLR3 MDCK CRISPR/Cas9 新城疫病毒

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TLR4^-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究

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中国预防兽医学报 2019年第12期41卷 1244-1250页

作者：王辉鲁国涛许曼曾为俊邵玉乐赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF... 详细信息

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。

关键词： TLR4 CRISPR/Cas9系统 DF1 基因敲除 NDV

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一株H10N1亚型禽流感病毒的遗传演化及其对小鼠的感染性研究

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中国预防兽医学报 2019年第3期41卷 305-308页

作者：王昌建彭志王卫国唐小明鲁杏华林源邓国华何世成湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了解从湖南省某活禽市场分离的一株鸭源H10N1亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hunan/S10078/2015(H10N1)(简称Hu N/78/15)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列的测定及遗传演化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染试验。序列分析结果显... 详细信息

为了解从湖南省某活禽市场分离的一株鸭源H10N1亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hunan/S10078/2015(H10N1)(简称Hu N/78/15)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列的测定及遗传演化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染试验。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点只含有一个碱性氨基酸,为低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。遗传演化分析结果表明该病毒的HA基因与NA基因分别来源于H10N7与H5N1亚型AIV,内部基因来源于H7N9、H4N6、H3N2、H11N7亚型AIV,呈现明显的遗传多样性。小鼠感染试验结果显示,Hu N/78/15能够在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,但仅引起小鼠轻微的体重变化,表明其对小鼠呈低致病性。本研究结果为H10亚型AIV的持续监测和生物学特性研究提供相应的参考依据。

关键词：禽流感病毒 H10N1亚型遗传演化分析感染性

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