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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议

作者：王俊勇曾艳徐帅杨佳运王婉冰殷雷钟波葛金英舒红兵陈化兰雷曹琦朱启运中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046 武汉大学生命科学院医学研究院武汉430071 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

H5N1亚型禽流感病毒(AIV)已经在16个国家和地区引起超过800人的感染病例,死亡率达53％.高致病性禽流感病毒的跨种间传播和重组,并导致动物发病或死亡是当前研究的热点.其中H5N1 AIV的非结构蛋白NS1是影响病毒毒力的重要决定因子之一.本...

H5N1亚型禽流感病毒(AIV)已经在16个国家和地区引起超过800人的感染病例,死亡率达53％.高致病性禽流感病毒的跨种间传播和重组,并导致动物发病或死亡是当前研究的热点.其中H5N1 AIV的非结构蛋白NS1是影响病毒毒力的重要决定因子之一.本研究团队前期临床分离的两株猪源H5N1亚型AIV具有高度同源的遗传背景,但对SPF鸡的致病表型却完全不同,前期研究结果表明,NS1效应区的5个氨基酸自然缺失导致其抑制Ⅰ型干扰素(IFN)产生的能力不同,并影响两株病毒在SPF鸡体内的复制水平(Zhu etal,J Virol,2008).本研究拟深入研究此5个氨基酸的自然缺失在哺乳动物或细胞中调控IFN产生的分子机制.首先,我们利用反向遗传技术将两株AIV的NS1(野生型称为NS1,缺失型称为NS1Δ)进行替换后拯救病毒,并感染A549/THP1细胞和BALB/c小鼠,结果表明NS1重组病毒抑制IFN产生的能力强于NS1Δ重组病毒.随后,利用生化实验和蛋白结构模拟实验进行分子机制研究,结果表明5个氨基酸缺失基序可通过两种途径影响IFN产生.(i)该5个氨基酸缺失导致NS1二聚体结构发生构象紊乱,导致NS1Δ结合双链RNA的能力下降,弱化对RIG-Ⅰ信号通路的抑制作用,导致宿主IFN诱生能力增强;(ii) E3泛素酶TRIM25是RIG-I分子活化的关键蛋白.NS1蛋白可以结合TRIM25分子的CCD区域,影响该抗病毒信号通路的活化.但5个氨基酸缺失减弱NS1Δ和TRIM25的相互作用以及对RIG-I信号通路活化的抑制作用,同样增强了宿主IFN的诱生能力.因此,本研究的结果表明：(i)高致病性禽流感病毒在与宿主进行相互作用的过程中,为了自己的生存,可以通过其编码蛋白NS1蛋白对其毒力进行微调,达到和宿主共生的平衡状态;(ii)本研究中鉴定的5个氨基酸缺失基序可以作为小分子药物设计的靶点,有助于流感病毒治疗或该病防控.

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H7N9流感病毒抑制RLR信号通路活化的蛋白鉴定和功能分析

H7N9流感病毒抑制RLR信号通路活化的蛋白鉴定和功能分析

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第五届全国禽病分子生物技术青年工作者会议

作者：王婉冰曾艳陈化兰雷曹琦朱启运中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 武汉大学生命科学院医学研究院武汉430071

H7N9 A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是对公共卫生安全危害严重的新发人兽共患病病原.2013年中国首次报道人和禽感染H7N9亚型IAV,此后该病在不同地区时有发生.自2016年冬季开始,我国H7N9呈现病例增多、散发程度高等特点.仅2017年3...

H7N9 A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是对公共卫生安全危害严重的新发人兽共患病病原.2013年中国首次报道人和禽感染H7N9亚型IAV,此后该病在不同地区时有发生.自2016年冬季开始,我国H7N9呈现病例增多、散发程度高等特点.仅2017年3月,我国卫计委官方通报96例人感染H7N9 IAV,其中47人死亡,死亡率超过48％.IAV可通过其病毒蛋白抑制干扰素(IFN)产生来逃避宿主免疫系统识别,从而形成持续感染,增强其致病力,已报道的IFN抑制蛋白有NS1,PB1-F2,PB2等.但仍有其它IFN抑制蛋白及其抑制机制尚不清楚.本研究拟以A/Environment/Suzhou/SZ19/2014 ( H7N9)流感毒株为研究对象,将该病毒所有蛋白基因克隆至pRK真核表达载体,并通过荧光素酶报告基因系统进行筛选,发现PB1蛋白(沉默PB1-F2基因)可以抑制RLR信号通路中IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活化,并具有剂量依赖性.然后在HEK293细胞中过表达PB1蛋白及其它信号分子,利用双荧光素酶报告基因实验和qPCR实验证实PB1可抑制RLRs信号通路的活化,并确定其作用的靶点在TBK1上游,可能是MAVS;接着为了进一步确定PB1蛋白作用的靶分子,我们通过免疫共沉淀检测PB1与RLRs信号通路分子的相互作用,发现PB1特异性的结合MAVS,随后我们利用免疫印迹实验检测PB1蛋白对MAVS表达量的影响,发现PB1可以降低MAVS的表达量,具体降解机制正在研究中.因此,本研究的实验数据初步表明,H7N9 PB1蛋白可抑制RLRs信号通路的活化,且可以与MAVS相互作用,具有降低MAVS表达量的功能,研究结果明确了H7N9 IAV PB1蛋白在天然免疫信号通路中的作用靶点,为防控H7N9流感提供理论依据.

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无特定病原体金定鸭微卫星DNA遗传多样性分析

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中国实验动物学报 2016年第3期24卷 299-303页

作者：赵丽丽陆涛峰张晓萍牛银杰陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

目的利用微卫星标记对无特定病原体金定鸭群进行遗传多样性分析。方法采用微卫星标记,对SPF金定鸭种群中71个个体进行遗传多样性分析。结果 SPF金定鸭种群中17个位点上共检测到119个等位基因,每个微卫星上等位基因数介于3~13;该SPF金定... 详细信息

目的利用微卫星标记对无特定病原体金定鸭群进行遗传多样性分析。方法采用微卫星标记,对SPF金定鸭种群中71个个体进行遗传多样性分析。结果 SPF金定鸭种群中17个位点上共检测到119个等位基因,每个微卫星上等位基因数介于3~13;该SPF金定鸭群体中有13个位点（PIC〉0.5）呈现出高度多态,平均杂合度为（0.5816±0.0142）,其他位点均呈现出中度多态。仅有5个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余12个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡,达到极显著水平（P〈0.01）。结论该SPF金定鸭群体内均存在丰富的遗传多样性,满足建立封闭群的遗传特征,可以利用该群体继续开展无特定病原体金定鸭封闭群的建立。

关键词： SPF金定鸭遗传多样性微卫星标记

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中国预防兽医学报 2017年第2期39卷 111-114页

作者：陈莹汪洋于颖李媛王琪邵家日王显兵周长平李继昌辛九庆东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 湖北工业大学生物工程与食品学院湖北武汉430065 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物支原体病团队黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学资源与环境学院黑龙江哈尔滨150030 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

Toll样受体2(TLR2)在鸡毒支原体(MG)诱导天然免疫反应机制中的作用尚未明确。为鉴定TLR2在MG脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导细胞表达IL-1β中的作用,本研究通过RT-PCR和ELISA方法检测LAMPs刺激后DF-1细胞中IL-1β的m RNA和蛋白水平,结果显示... 详细信息

Toll样受体2(TLR2)在鸡毒支原体(MG)诱导天然免疫反应机制中的作用尚未明确。为鉴定TLR2在MG脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导细胞表达IL-1β中的作用,本研究通过RT-PCR和ELISA方法检测LAMPs刺激后DF-1细胞中IL-1β的m RNA和蛋白水平,结果显示LAMPs可以诱导DF-1细胞分泌IL-1β,并确定最佳刺激时间为6 h,最佳刺激剂量为1μg/m L。此外,通过构建TLR2重组表达质粒p CMV-HA-TLR2,并将该质粒转染DF-1细胞进行过表达及通过抗体封闭TLR2的两种处理方式,处理后采用LAMPs刺激细胞。经检测显示:TLR2过表达处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平显著升高,而抗体处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平下调。结果表明,LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合,有效的诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β,而且IL-1β的释放可能与天然免疫系统的经典通路即NF-κB信号通路调控有关。本研究为阐述MG的致病机制提供相关实验依据。

关键词：鸡毒支原体脂质相关膜蛋白（LAMPs） TLR2

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基于分子对接方法的玉米赤霉烯酮和β-雌二醇分别与雌激素受体α的结合能分析

基于分子对接方法的玉米赤霉烯酮和β-雌二醇分别与雌激素受体α...

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：张圆圆周妍刁晨曦陆涛峰赵丽丽韩凌霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室/实验动物与比较医学团队

目的为玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）类雌激素作用的机理提供理论依据。方法利用绘图软件和对接软件考察ZEN和β-雌二醇（beta estradiol,E2）与鼠雌激素受体α（Estrogen Receptor alpha,ERα）的分子对接情况,分析两者与ERα的结... 详细信息

目的为玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）类雌激素作用的机理提供理论依据。方法利用绘图软件和对接软件考察ZEN和β-雌二醇（beta estradiol,E2）与鼠雌激素受体α（Estrogen Receptor alpha,ERα）的分子对接情况,分析两者与ERα的结合能。结果 E2和ZEN与ERα的结合能分别为-11.5 kcal·mol和-8.6 kcal·mol;两者都位于疏水性较强的活性口袋中,苯环都与Phe-404和Arg-394形成了CH-π和阳离子-π的相互作用;E2的羟基分别5个氨基酸形成氢键,其中一个羟基与水分子形成了保守的氢键。结论分子对接提供了E2和ZEN分别与ERα结合的相互作用力的可视化分析结果,证明了ZEN与ERα具有亲和力,但低于E2。

关键词：玉米赤霉烯酮雌激素受体α 分子对接结合能

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MHC单倍体型SPF鸭的遗传学检测技术的优化

MHC单倍体型SPF鸭的遗传学检测技术的优化

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第十三届中国实验动物科学年会

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

目的优化无特定病原体(SPF)主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭HBW-SPF的遗传学稳定性检测技术。方法以中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(国家禽类实验动物种子中心)培育并保存的F1至F5世代HBW-SPF鸭为基础,根据位于MHC区域的鸭抗原处理... 详细信息

目的优化无特定病原体(SPF)主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭HBW-SPF的遗传学稳定性检测技术。方法以中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(国家禽类实验动物种子中心)培育并保存的F1至F5世代HBW-SPF鸭为基础,根据位于MHC区域的鸭抗原处理相关转运体分子(Tap)基因,分别基于Tap1基因组序列的短串联重复序列(STR)、Tap2的肽结合区序列以及Tap2全基因组序列,分析F1-F3代HBW-SPF鸭的遗传稳定性。结果 F0鸭的STR技术,在F1代完全稳定;F1代约2 kb的编码区序列存在多个变异点,且都有2个等位基因,根据STR标记确定的单倍型与毗邻的Tap2基因未完全连锁;利用基因组序列对F2代的遗传学检测中,B1和B2群鸭完全保守,B3鸭出现24个变异点,且皆为2个等位基因。利用Tap2基因组1-714和1-663 nt的核苷酸序列与F0代进行比对,结果 1-663 nt检测序列完全纯合。结论根据Tap2基因组的1-663 nt的核苷酸序列区域建立的分型技术,适合MHC单倍型SPF鸭的遗传学质量监测。

关键词：主要组织相容性复合体无特定病原体单倍体型鸭抗原处理相关转运体

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禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF鸡免疫器官和疫苗免疫效果的影响

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畜牧兽医学报 2016年第2期47卷 340-345页

作者：李凯高立祁小乐高宏雷高玉龙王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽免疫抑制病研究团队哈尔滨150001

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类的一种重要免疫抑制性疾病,目前对其造成免疫抑制的机制尚不十分清楚。本研究对实验室分离的一株REV流行毒株(HLJR0901株)感染1日龄SPF鸡后对感染鸡免疫器官和免疫功能造成的影响进行研究。结果表明,1日... 详细信息

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类的一种重要免疫抑制性疾病,目前对其造成免疫抑制的机制尚不十分清楚。本研究对实验室分离的一株REV流行毒株(HLJR0901株)感染1日龄SPF鸡后对感染鸡免疫器官和免疫功能造成的影响进行研究。结果表明,1日龄SPF鸡感染REV后出现生长迟缓,法氏囊、胸腺萎缩,脾肿大的症状。感染鸡出现法氏囊滤泡淋巴细胞大量坏死减少,间质结缔组织增生;胸腺出血,胸腺小体增多;脾小结明显萎缩,淋巴细胞减少等病理变化。荧光定量PCR检测发现,病毒在感染鸡法氏囊、胸腺和脾内均有分布,且持续存在。SPF鸡感染REV后出现严重的免疫抑制,使AIV灭活疫苗和NDV弱毒疫苗的免疫效果显著下降。本研究为阐明REV的免疫抑制机制提供了重要的实验数据。

关键词：禽网状内皮组织增生病致病性免疫器官免疫抑制

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鸭抗原处理相关转运体单克隆抗体的制备及其初步应用

鸭抗原处理相关转运体单克隆抗体的制备及其初步应用

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2017年第十五届中国北方实验动物科技年会

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为制备鸭抗原处理相关转运体（TAP）肽结合区（PBD）特异性单克隆抗体（mAb）并鉴定其抗原表位,本研究以原核系统表达鸭截短的TAP2蛋白（TAP2PBD）,并对表达的TAP2PBD进行纯化免疫BAIB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,... 详细信息

为制备鸭抗原处理相关转运体（TAP）肽结合区（PBD）特异性单克隆抗体（mAb）并鉴定其抗原表位,本研究以原核系统表达鸭截短的TAP2蛋白（TAP2PBD）,并对表达的TAP2PBD进行纯化免疫BAIB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,以原核表达纯化的TAP2PBD蛋白为检测抗原,采用ELISA的检测方法筛选杂交瘤细胞系,获得一株稳定分泌抗TAP2PBD的mAb杂交瘤细胞系（1A6）。该mAb亚型鉴定为IgM型,轻链为k链。免疫组化试验显示1A6可以特异性识别真核组织表达的TAP蛋白。通过截短表达TAP2PBD蛋白鉴定该mAb的抗原表位为NARHQMLQQAVLDATAGTGMVAQEAI,序列分析表明该抗原表位在鸭中保守。本研究制备的mAb首次利用鸭TAP蛋白特异性单抗检测到TAP蛋白在亚细胞水平的表达,为进一步研究鸭TAP同免疫遗传的关系奠定了基础。

关键词：鸭抗原处理相关转运体原核表达单克隆抗体

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表达兔瘟病毒VP60基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

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免疫学研究 2017年第2期5卷 11-18页

作者：原冬伟鲁文赓黄艳秋郭东华薛飞曲连东黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人兽共患病研究团队黑龙江哈尔滨

为了构建表达兔瘟病毒VP60基因的牛疱疹病毒I型,首先构建含有兔瘟病毒VP60基因和CMV启动子的转移载体,然后将构建移载体与gE基因缺失的牛疱疹病毒I型基因组共转染牛肺细胞后收获增殖的病毒。通过蓝白斑筛选不含有LacZ基因的白色病毒蚀斑... 详细信息

为了构建表达兔瘟病毒VP60基因的牛疱疹病毒I型,首先构建含有兔瘟病毒VP60基因和CMV启动子的转移载体,然后将构建移载体与gE基因缺失的牛疱疹病毒I型基因组共转染牛肺细胞后收获增殖的病毒。通过蓝白斑筛选不含有LacZ基因的白色病毒蚀斑,反复纯化获得重组病毒BHV-1-VP60。PCR方法验证VP60基因的成功插入,间接免疫荧光试验和Western blot,结果证明了BHV-1-VP60中的VP60基因在易感细胞中获得了表达。本研究成功地构建了兔瘟病毒VP60基因的重组病毒BHV-1-VP60,为研制新型兔瘟活载体疫苗奠定了基础。

关键词：兔瘟病毒 VP60基因牛疱疹病毒1型蓝白斑筛选

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兽用疫苗中实验动物替代方法的研究进展

兽用疫苗中实验动物替代方法的研究进展

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第八届北京实验动物科学国际论坛

作者：王兴童韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

本文介绍了兽用生物制品中非动物替代方法的应用及研究进展,并从兽用疫苗效力检验、安全检验方面介绍了部分兽用疫苗的非动物替代方法.同时对适合建立替代方法的兽用疫苗进行分析,以期为兽用疫苗替代方法研究提供参考.

关键词：兽用疫苗效力检验安全检验非动物实验

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