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湖南农业大学学报（自然科学版） 2015年第3期41卷 299-302页

作者：黄建龙王昌建邓国华范仲鑫何世成朱春霞唐小明刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了解环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感病毒的分布和流行情况,分别于2009—2011年对环洞庭湖地区活禽批发市场、2011—2013年对水禽场的H6亚型禽流感进行了系统监测。对在活禽批发市场上采集的拭子样品先由尿囊腔接种SPF鸡... 详细信息

为了解环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感病毒的分布和流行情况,分别于2009—2011年对环洞庭湖地区活禽批发市场、2011—2013年对水禽场的H6亚型禽流感进行了系统监测。对在活禽批发市场上采集的拭子样品先由尿囊腔接种SPF鸡胚,然后用血凝试验(HA)测定所收集的尿囊液,对HA测定有滴度的再进行血凝抑制试验(HI),并与RT–PCT方法相结合鉴定病毒的亚型。检测结果显示:在环洞庭湖区的5个活禽批发市场上都分离到H6亚型禽流感,并且在鸡、鸭、鹅拭子中都分离到该病毒,总的分离率为6.49%;水禽场H6亚型禽流感病毒群体阳性率达3.6%,拭子的H6亚型病毒分离率为0.29%,活禽批发市场鸭拭子H6亚型禽流感病毒分离率为9.58%,表明市场环节水禽H6亚型禽流感的隐性带毒率比养殖环节高,在一定程度上说明禽流感在活禽批发市场存在水平传播的风险。

关键词：活禽批发市场水禽场 H6亚型禽流感病毒洞庭湖区

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应用酵母双杂交方法筛选与马传染性贫血病毒Rev蛋白相互作用的蛋白

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中国预防兽医学报 2015年第4期37卷 315-317页

作者：苏朝尹鑫马建王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病与慢病毒团队黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)蛋白与马巨噬细胞蛋白之间的相互作用,本研究利用SMART技术构建了马巨噬细胞的酵母双杂交c DNA文库,并利用该文库调取与EIAV Rev蛋白相互作用的细胞蛋白,构建诱饵质粒p GBKT7-rev,通过表型检测Rev的自激活... 详细信息

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)蛋白与马巨噬细胞蛋白之间的相互作用,本研究利用SMART技术构建了马巨噬细胞的酵母双杂交c DNA文库,并利用该文库调取与EIAV Rev蛋白相互作用的细胞蛋白,构建诱饵质粒p GBKT7-rev,通过表型检测Rev的自激活和细胞毒性作用,并与构建的文库进行杂交筛选。对获得阳性克隆进行序列测定和比对分析,根据分析结果进行共转化验证。结果显示,文库的容量为3×108 cfu/m L。Rev蛋白在酵母双杂交系统中无自激活现象和细胞毒性作用。此外,本实验共筛选得到5个与EIAV Rev相互作用的宿主细胞蛋白。本研究为进一步研究Rev蛋白的生物学新功能奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒 Rev蛋白酵母双杂交cDNA文库马巨噬细胞

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加系SPF大白、长白猪SLA-1基因多态性研究

加系SPF大白、长白猪SLA-1基因多态性研究

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2016第十四届中国北方实验动物科技年会

作者：权金强高彩霞江新杰李昌文路小野陈洪岩牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011 甘肃农业大学动物科学技术学院兰州 730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨 150069 牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011

目的：研究加系SPF大白、长白猪SLA-1基因的多态性. 方法:采取15头大白猪和22头长白猪血液,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录cDNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增测序,获得等位基因序列进行多态性分析. 结果:成功获得16个SLA-... 详细信息

目的：研究加系SPF大白、长白猪SLA-1基因的多态性. 方法:采取15头大白猪和22头长白猪血液,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录cDNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增测序,获得等位基因序列进行多态性分析. 结果:成功获得16个SLA-1等位基因,其中4个为新等位基因,由ISAG SLA命名委员会命名为SLA-1*0703、SLA-1*0704、SLA-1*0811、SLA-1*0812.在全长1086bp的完整开放阅读框(ORF),核苷酸多样度(Pi)为0.04559,单倍型多样度(Hd)为0.00049,平均核苷酸差异数(K)为49.508,150个核苷酸变异位点中简约信息位点远高于单一多态位点;共编码361个氨基酸产生183个突变,非同义突变远高于同义突变.胞外区a1、a2存在33个关键氨基酸,其中9个为保守氨基酸,其余24个均发生高频率突变,它们共同构成了6个抗原肽结合槽口袋(A-F). 结论:本研究成功鉴定了16个SLA-1等位基因,具有高度的多态性,且高变区集中于第2、3外显子,对SPF大白、长白猪构建动物模型具有至关重要的作用.

关键词：大白猪长白猪 SLA-1基因多态性

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支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株构建及生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2015年第2期37卷 101-105页

作者：翟莹郭东春王林柏刘家森田进刘春国刘大飞姜骞曲连东东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人兽共患病创新团队黑龙江哈尔滨150001

为研究Hfq蛋白在支气管败血波氏杆菌(Bb)的致病作用,本研究采用同源重组技术,将卡那霉素抗性基因替换Bb122株的hfq基因,构建BbΔhfq突变株。将其连续传20代,Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性。生化检测试验表明,突变株与亲本株未发生明... 详细信息

为研究Hfq蛋白在支气管败血波氏杆菌(Bb)的致病作用,本研究采用同源重组技术,将卡那霉素抗性基因替换Bb122株的hfq基因,构建BbΔhfq突变株。将其连续传20代,Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性。生化检测试验表明,突变株与亲本株未发生明显改变。此外,在37℃培养时,突变株与亲本株生长曲线无明显差异,但在42℃培养时,突变株的生长曲线略低于亲本株。抗逆性试验表明,突变株与亲本株在紫外线照射和50℃条件下,亲本株的耐受能力均显著高于突变株(p<0.05)。然而,将亲本株与突变株分别以2×109cfu/只腹腔接种小鼠时,亲本株接种小鼠全部死亡,而突变株接种小鼠则全部存活,表明Hfq蛋白与该菌的致病性有关。本研究为进一步研究Hfq蛋白的功能及其在Bb致病机制中的作用奠定了基础。

关键词：支气管败血波氏杆菌 hfq基因突变株致病性

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猪肾细胞源三种蛋白质对猪圆环病毒2型复制的调节作用

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畜牧兽医学报 2015年第11期46卷 2040-2049页

作者：张辉唐青海黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001 南阳师范学院南阳市兽医生物工程技术研究中心/昆虫生物反应器河南省工程实验室南阳473061

为了验证猪肾细胞系(PK-15)源3种蛋白质基因(AP2α2、Elf4和ISCU)表达水平对猪圆环病毒2型(PCV2)复制的调节作用,采用RT-PCR扩增这3种蛋白质编码基因,构建真核表达载体;同时设计这3种蛋白质的RNAi片段,分别插入到pGPU6-GFP载体构建shRN... 详细信息

为了验证猪肾细胞系(PK-15)源3种蛋白质基因(AP2α2、Elf4和ISCU)表达水平对猪圆环病毒2型(PCV2)复制的调节作用,采用RT-PCR扩增这3种蛋白质编码基因,构建真核表达载体;同时设计这3种蛋白质的RNAi片段,分别插入到pGPU6-GFP载体构建shRNA干扰载体。以荧光定量PCR法检测干扰效率,选取干扰效率较高的干扰载体,利用G418筛选转染真核表达载体或干扰载体后的PK-15细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)法检测PCV2LG毒株在这些细胞中的复制效率。结果表明,Elf4蛋白和ISCU蛋白基因过表达能够显著增强PCV2的复制;而AP2α2蛋白基因过表达对PCV2的复制无显著影响。AP2α2、ISCU和Elf4这3种蛋白质基因被干扰表达后均可降低PCV2复制效率,表明这3种宿主细胞蛋白质对该病毒复制具有调节作用。

关键词：猪圆环病毒2型复制 AP2α2 Elf4 ISCU

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结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2015年第2期45卷 172-176页

作者：崔莹莹宋宁宁党光辉曹俊李华芳于申业刘思国吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋... 详细信息

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv3295基因原核表达单克隆抗体

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表达禽网状内皮组织增生病病毒ggpp90蛋白的毕赤酵母基因工程菌发酵工艺优化研究

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中国家禽 2015年第9期37卷 16-20页

作者：李凯刘鹤赵宪成高宏雷王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司黑龙江哈尔滨150001

禽网状内皮组织增生病(RE)是危害养禽业的重要传染病,基因工程亚单位疫苗是防治该病的最佳选择。研究对表达REV主要保护性抗原基因gp90的重组毕赤酵母基因工程菌株进行了发酵工艺优化,以实现重组gp90蛋白的高效稳定表达。发酵培养基、... 详细信息

禽网状内皮组织增生病(RE)是危害养禽业的重要传染病,基因工程亚单位疫苗是防治该病的最佳选择。研究对表达REV主要保护性抗原基因gp90的重组毕赤酵母基因工程菌株进行了发酵工艺优化,以实现重组gp90蛋白的高效稳定表达。发酵培养基、诱导温度和诱导酸碱度的优化结果表明,当诱导温度为28℃,诱导pH6.0,基础盐培养基中CaSO4、MgSO4、K2SO43种硫酸盐的使用量降低至常用浓度的50%时,目的蛋白获得高水平稳定表达,表达的重组蛋白具有良好生物活性和稳定性。本系列优化试验为重组gp90蛋白制备基因工程亚单位疫苗的产业化奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生病 gp90蛋白毕赤酵母发酵工艺优化

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一株抗马传染性贫血病毒p26蛋白单克隆抗体识别差异表位鉴定

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中国预防兽医学报 2015年第2期37卷 152-154页

作者：常浩胡哲戈曼郭继珂王晓钧周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病与慢病毒创新团队黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学内蒙古呼和浩特010018

为研究本实验室制备的抗马传染性贫血病毒（EIAV）p26蛋白单克隆抗体（MAb）1G11的B细胞表位识别特性,本研究通过对不同EIAV株p26蛋白进行系统进化分析,将其划分为3大分支群。根据已经鉴定的线性表位（命名为1G11）,通过对3个分支群中的... 详细信息

为研究本实验室制备的抗马传染性贫血病毒（EIAV）p26蛋白单克隆抗体（MAb）1G11的B细胞表位识别特性,本研究通过对不同EIAV株p26蛋白进行系统进化分析,将其划分为3大分支群。根据已经鉴定的线性表位（命名为1G11）,通过对3个分支群中的8株代表性病毒株p26蛋白1G11表位区域分析,并原核表达8株病毒1G11表位区域多肽P26-（1～8）,经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果表明除表位多肽P26-7以外,其他多肽均能够被MAb 1G11所识别。分析显示P26-7多肽序列同时发生N^200S和M^215L变异。由于N^200S和M^215L单独改变并不影响MAb 1G11识别,因此我们推测N^200与M^215同时改变可能影响两侧末端半胱氨酸（C）及附近氨基酸所形成的表位构象,进而影响MAb 1G11识别;同时,其他氨基酸差异并不影响MAb 1G11识别,表明该抗体对1G11表位区域识别具有广谱性。这为进一步应用该MAb作为检测抗体和开发广谱性诊断检测方法提供了依据。

关键词：马传染性贫血病毒 p26蛋白单克隆抗体1G11 1G11表位

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犬吉氏巴贝斯虫BgTRAP的原核表达及抗原表位分析

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中国预防兽医学报 2015年第1期37卷 27-30页

作者：陈亚萍孟祥春王曼宇刘景梅高洋贾洪林鲁承延边大学农学院动物医学系吉林延吉133000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密西根州立大学天然免疫联合实验室黑龙江哈尔滨150001

为表达犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白及鉴定其抗原表位,本研究将犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP编码基因的密码子进行优化和高效表达,并利用生物学软件分析预测,结果显示,Bg TRAP中存在10个潜在的线性抗原表位,通过原核表达系统对其预测表位的多肽... 详细信息

为表达犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白及鉴定其抗原表位,本研究将犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP编码基因的密码子进行优化和高效表达,并利用生物学软件分析预测,结果显示,Bg TRAP中存在10个潜在的线性抗原表位,通过原核表达系统对其预测表位的多肽进行表达,以筛选的阳性血清样品为检测抗体进行ELISA检测,结果表明其中3个多肽能够与抗体特异性结合,其多肽序列分别为126DYVIAVEDTTHFGE139、672AYILAGFA GLLLIT685和497SDELGDEMGLTTNE510。本研究对Bg TRAP蛋白抗原表位的鉴定,为进一步开发基于Bg TRAP的犬吉氏巴贝斯虫诊断抗原及Bg TRAP的免疫学特性研究奠定了基础。

关键词：密码子优化间接免疫荧光抗原表位

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兔出血症病毒肝脏表面蛋白受体的初步筛选

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中国兽医学报 2015年第12期35卷 1893-1897页

作者：陈淑慧刘家森黄艳秋单丽玲郭东春姜骞李志杰崔玉东曲连东黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163310 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在... 详细信息

为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在130000-170000的位置上存在与RHDV相互作用的特异性蛋白条带；利用液相色谱联合质谱技术（LCMS／MS）对特异蛋白条带进行shotgun分析，鉴定得到38个候选蛋白，其中3种蛋白在已知病毒感染过程中具有重要作用。

关键词：兔出血症病毒病毒铺覆蛋白技术液相色谱联合质谱肝脏细胞表面蛋白

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