检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 225-231页

作者：赵济钰王璐孙婧王春来李刚刘思国东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm ... 详细信息

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 MnmE基因基因突变株

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非洲猪瘟病毒A137R蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第4期44卷 402-410页

作者：向志达李长尧张涛清张元峰黄丽杨玉莹翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069 长江大学动物科学学院湖北荆州434025

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)A137R蛋白鼠源单克隆抗体(MAb),本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R),将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3。亚类试剂盒鉴定结果显示,两... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)A137R蛋白鼠源单克隆抗体(MAb),本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R),将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3。亚类试剂盒鉴定结果显示,两株MAb重链亚类均为IgG1,轻链亚类均为Kappa链。采用间接ELISA方法测得MAb 3D1和2C3的腹水效价均高于10^(5),选取效价较高的MAb 3D1用于后续试验。采用western blot检测制备的MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的A137R的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R的反应性。Western blot结果显示,过表达A137R的293T细胞出现了15 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量浓度的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAMs中(感染后8 h)出现了15 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加。IFA结果显示,在过表达A137R的293T细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的MAb 3D1既能够与过表达的A137R反应,也能够与天然表达的A137R反应,反应性较强。将MAb 3D1用于激光共聚焦试验中检测ASFV感染PAMs后不同时间A137R的细胞定位;用于免疫共沉淀(Co-IP)试验中检测293T细胞中过表达的A137R和Flag-Agarose结合的反应性。激光共聚焦试验结果显示,ASFV感染PAMs后6 h出现绿色荧光,且荧光主要在细胞质中,随着感染时间的延长,绿色荧光逐渐增多增强,表明A137R主要定位于细胞质中。Co-IP试验结果显示,MAb 3D1可以检测到结合在Beads上的A137R,出现约15 ku的特异性条带,表明MAb 3D1可以用于Co-IP试验。利用一系列表达部分重叠的重组A137R片段并经western blot鉴定两株MAb识别的表位;根据western blot结果合成一系列多肽并包被ELISA板,采用间接ELISA方法进一步筛选MAb识别的抗原表位,并利用western blot验证筛选到的抗原表位。结果显示,A137R氨基酸序列中的18NFHRCAWEE26和64AWHEVPECREFI75分别为MAb 3D1和2C3的抗原表位。本研究首次制备了ASFV A137R蛋白的MAb,并进行了初步应用研究,还对其进行了表位鉴定,为进一步将该MAb利用于ASFV的检测和疫苗研究提供了实验依据。

关键词：非洲猪瘟病毒 A137R蛋白单克隆抗体抗原表位

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N9亚型禽流感病毒NA蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第7期44卷 777-781页

作者：衡武昌崔鹏飞张元成邢鑫谷文丽颜成孔兴天王丛丛彭大新邓国华陈化兰扬州大学兽医学院江苏扬州225009 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了... 详细信息

为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了重组杆粒rBacmid-N9,转染昆虫细胞sf21获得重组杆状病毒rBaculovirus-N9。将获得的P3代重组杆状病毒感染sf21细胞后经间接免疫荧光试验(IFA)检测N9蛋白的表达和定位,采用western blot鉴定N9蛋白的反应原性。将杆状病毒表达的重组N9蛋白包被ELISA酶标板,初步建立间接ELISA方法,利用该方法分别检测N9蛋白抗体阳性鸡血清和阴性鸡血清。IFA和western blot结果显示,N9蛋白正确表达且主要锚定在细胞膜上,表达的N9蛋白可以与鼠源N9蛋白单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA方法结果显示,初步建立的间接ELISA方法可以检测鸡血清中的N9抗体。上述结果表明,经杆状病毒—昆虫细胞表达的N9蛋白具有良好的反应原性,为N9 AIV检测试剂盒的研发奠定了基础。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶 N9亚型昆虫细胞杆状病毒

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现用重组AIV(H5+H7)三价灭活疫苗对近期H5和H7亚型AIV分离株的免疫效力研究

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中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 514-520页

作者：刘艳晶麻琦潘舒心和新文王燕邓国华李雁冰施建忠包红梅毛胜刚胡井雷路通刘景利郭兴福田国彬曾显营陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/国家禽流感参考实验室/国家禽类实验动物资源库黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司黑龙江哈尔滨150069

为评估现用重组禽流感病毒(AIV)(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9 H7-Re3株)对我国近期H5和H7亚型AIV分离株的免疫预防效果,本研究对60只3周龄SPF鸡以肌肉注射途径接种该疫苗(0.3 mL/只),另外,60只鸡注射PBS作为阴性对照... 详细信息

为评估现用重组禽流感病毒(AIV)(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9 H7-Re3株)对我国近期H5和H7亚型AIV分离株的免疫预防效果,本研究对60只3周龄SPF鸡以肌肉注射途径接种该疫苗(0.3 mL/只),另外,60只鸡注射PBS作为阴性对照组;免疫3周后分组,每10只免疫鸡和10只对照鸡为一组,共6组,采集各组鸡血清并检测针对6株AIV分离株(2020年~2021年分离的4株H5N6、1株H5N8和1株H7N9亚型AIV)的相应HI抗体效价。同时用上述6株AIV分离株作为抗原差异代表株,分别以105EID50的剂量进行攻毒试验,攻毒后5 d采集各组所有存活鸡的喉头和泄殖腔拭子样品,死亡鸡样品随时采集,进行排毒检测。HI抗体检测结果显示,免疫后3周,5组免疫鸡血清中针对H5亚型Re-11株和Re-12株抗原的HI抗体效价在8log2~8.6log2,针对4株H5N6 AIV分离株(DK/HuN/S11553/2020、 DK/GD/SC001/2020、 DK/FJ/S1424/20和GS/GZ/S1569/21)和1株H5N8 AIV分离株(WS/SX/4-1/20)的平均抗体效价分别为5.0log2、4.6 log2、4.3log2、3.8 log2、3.7log2;针对H7N9 AIV H7-Re3株的HI抗体效价为7.8log2,而针对H7N9 AIV分离株CK/YN/SD024/21的平均抗体效价为4.0log2;对照组鸡血清中针对疫苗株和所有分离株的HI抗体均为阴性。表明上述分离株与现用疫苗株存在较大抗原性差异。攻毒后14 d的观察期内,所有免疫组鸡均健活,且攻击3株H5N6和1株H7N9 AIV分离株的免疫组鸡均不排毒,但攻击1株H5N6 AIV分离株(GS/GZ/S1569/21)和H5N8 AIV分离株的免疫组分别有2/10和3/10只鸡的喉头拭子样品中检测到低水平的病毒;所有对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡,且死亡对照组鸡的喉头和泄殖腔拭子样品均呈AIV阳性。以上结果表明,以近期野鸟或家禽中分离的H5和H7亚型AIV抗原变异株攻击各组鸡后,现用的H5+H7 AIV三价灭活疫苗可对免疫鸡提供无临床发病的保护,并可有效阻止分离株在鸡体内的复制。本研究为H5和H7三价疫苗的应用及更新提供了科学依据。

关键词：禽流感 H5+H7亚型三价灭活疫苗抗原变异株免疫效力

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禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗对家禽的免疫效力研究

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1293-1298,1317页

作者：潘舒心刘艳晶麻琦陈晓涵邓国华施建忠田国彬曾显营陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为评估禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗(rBH5-11株+rBH5-12株+rBH7-2株)对家禽的免疫保护效果,本研究将制备的3批疫苗接种21日龄SPF鸡,并进行疫苗的效力检测及H5和H7亚型禽流感病毒(AIV)流行株的攻毒试验;同时将该疫苗接种... 详细信息

为评估禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗(rBH5-11株+rBH5-12株+rBH7-2株)对家禽的免疫保护效果,本研究将制备的3批疫苗接种21日龄SPF鸡,并进行疫苗的效力检测及H5和H7亚型禽流感病毒(AIV)流行株的攻毒试验;同时将该疫苗接种商品蛋鸡和鸭,进行免疫抗体持续期研究。疫苗免疫效力试验结果显示,3批疫苗常规剂量(0.3 mL/只)分别接种SPF鸡后3周,免疫鸡血清中针对H5亚型Re-11株和Re-12株、H7亚型H7-Re2株AIV的平均HI抗体效价为7.9 log2~8.5 log2,对照组鸡血清中针对3种抗原的HI抗体均为阴性;用H5N6、H5N1和H7N9亚型AIV分别攻毒后10 d观察期内,对照鸡均全部发病死亡,所有免疫组鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护。流行株的效力试验结果显示,免疫后3周,接种常规剂量(0.3mL/只)疫苗鸡血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在7.9 log2以上,使用2株H5N6亚型AIV、2株H5N1亚型AIV及1株H7N9亚型AIV和1株H7N2亚型AIV流行株攻毒后,各免疫组鸡均获得100%的免疫保护。抗体持续期试验结果显示,80日龄商品蛋鸡在接种2次疫苗(0.5 mL/只)3周至16周,血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在6.8 log2以上;2周龄鸭接种2次疫苗(0.5 mL/只),在首次免疫后3周至14周,血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在6 log2以上。上述结果首次表明,禽流感杆状病毒载体三价灭活疫苗具有良好的免疫效力,能够预防H5亚型和H7亚型禽流感(AI),商品蛋鸡和鸭按照免疫程序接种2次疫苗后能够产生持久的HI抗体。本研究为禽流感疫苗的研制提供了新思路和科学依据。

关键词：禽流感杆状病毒载体灭活疫苗 H5+H7 免疫效力

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猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究

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中国兽医科学 2021年第8期51卷 1007-1014页

作者：边海桥黄立平危艳武夏德利朱红振吴洪丽于冲刘建行冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用真核细胞表达系统制备了猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白,旨在探索病毒样颗粒(VLPs)的形成及其免疫原性。以pCAGGS为表达载体构建了重组质粒pCAGGS-Cap-Flag,瞬时转染293T细胞,利用Flag标签对表达的Cap蛋白进行纯化。通过电镜观察重... 详细信息

利用真核细胞表达系统制备了猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白,旨在探索病毒样颗粒(VLPs)的形成及其免疫原性。以pCAGGS为表达载体构建了重组质粒pCAGGS-Cap-Flag,瞬时转染293T细胞,利用Flag标签对表达的Cap蛋白进行纯化。通过电镜观察重组Cap蛋白形成的VLPs形态表明,纯化的重组Cap蛋白以VLPs形式存在,其直径约17 nm,与自然PCV2病毒粒子一致。SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明,重组Cap蛋白为28.7 ku,分子质量符合预期,它与PCV2特异性单抗具有良好的免疫活性反应。捕获ELISA检测显示,重组Cap蛋白所组装的VLPs与纯化的自然PCV2具有相似的抗原活性。用制备的VLPs与经典的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,这两种疫苗均能诱导良好的PCV2抗体应答反应,VLPs免疫组小鼠的抗体效价最高可达1∶12800,是PCV2灭活疫苗免疫组抗体效价的2倍。采用PCR检测免疫攻毒后小鼠肺组织中PCV2核酸,结果显示,VLPs免疫组和PCV2灭活疫苗免疫组均未检测到PCV2核酸,判定100%保护。本研究通过真核细胞表达系统制备的PCV2 VLPs具有与自然病毒粒子相似的形态结构,免疫小鼠可产生良好的免疫反应,可用于新型PCV2疫苗的研制。

关键词：猪圆环病毒2型病毒样颗粒免疫原性

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伪狂犬病病毒感染对小鼠脑组织免疫蛋白酶体表达影响的研究

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中国预防兽医学报 2021年第1期43卷 65-70页

作者：胡薇刘强张永莉马泽林肖菲张险峰何希君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

在炎症反应或在氧化应激的情况下,机体内的蛋白酶体会转变成免疫蛋白酶体,从而在炎症类疾病中发挥作用。为了研究免疫蛋白酶体在伪狂犬病毒(PRV)感染中的作用,本研究随机将25只C57BL/6小鼠分成5组,5只/组,1组对照组,4组实验组:分别为感... 详细信息

在炎症反应或在氧化应激的情况下,机体内的蛋白酶体会转变成免疫蛋白酶体,从而在炎症类疾病中发挥作用。为了研究免疫蛋白酶体在伪狂犬病毒(PRV)感染中的作用,本研究随机将25只C57BL/6小鼠分成5组,5只/组,1组对照组,4组实验组:分别为感染5 d(5 dpi)组、感染7 d(7 dpi)组、感染9 d(9 dpi)组和感染11 d(11 dpi)组。将PRV Bartha株以6.8×10^(4) TCID50的剂量经后肢皮下注射感染小鼠,每天观察其临床症状。在感染后的11 d内,小鼠出现了被毛凌乱、体重减轻和轻微的神经症状。于感染后的第5 d、7 d、9 d和11 d颈椎脱臼迫杀各组小鼠后采集脑组织,经荧光定量PCR方法检测小鼠脑组织的病毒拷贝数。结果显示,在小鼠脑组织检测出了PRV,且9 dpi组小鼠病毒的拷贝数高达4.93×10^(6)拷贝/μL;小鼠脑组织病理切片可见,小鼠产生了非化脓性脑炎,脑组织出现血管套现象并伴有炎性细胞的浸润;经荧光定量PCR方法检测各组小鼠脑组织免疫蛋白酶体亚基和促炎性细胞因子的转录水平。结果显示,各感染组小鼠脑组织免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7以及LMP10的转录水平均明显上调,其中LMP2亚基的转录水平最高,与对照组相比9 dpi组小鼠脑组织LMP2亚基的转录水平上调了332倍(p<0.001);各感染组小鼠促炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-1β和TNF-α的转录水平也均上调,其中9 dpi组小鼠的IFN-γ转录水平与对照组相比上调了1420倍(p<0.01)。Western blot结果显示,各感染组小鼠脑组织免疫蛋白酶体亚基LMP2、LMP7和LMP10均被诱导表达。上述结果表明PRV Bartha株感染小鼠后,会诱发其脑组织炎症和免疫蛋白酶体的表达,且随着感染时间的延长(5 dpi~9 dpi),小鼠脑组织炎性因子与免疫蛋白酶体亚基的转录水平和蛋白表达水平均呈增加趋势。本实验为研究免疫蛋白酶体在PRV致病机理中的作用奠定了基础,并为进一步研究疱疹病毒诱发的中枢神经系统炎症反应提供了参考依据。

关键词：免疫蛋白酶体伪狂犬病毒脑炎促炎性细胞因子

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猫细小病毒嵌合抗体基因在CHO-K1细胞中的稳定表达及其特性分析

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1318-1323页

作者：王文静薛雨佳陈慧宇姚楠刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为降低鼠源单克隆抗体(MAb)在猫体内引起的免疫原性,本研究针对猫细小病毒(FPV)制备具有猫源抗体恒定区基因的鼠-猫嵌合抗体。本研究首先克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重、轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重、轻链恒定区基因,通过融... 详细信息

为降低鼠源单克隆抗体(MAb)在猫体内引起的免疫原性,本研究针对猫细小病毒(FPV)制备具有猫源抗体恒定区基因的鼠-猫嵌合抗体。本研究首先克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重、轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重、轻链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-猫重组重、轻链基因片段(C_(H)/C_(L)),构建嵌合抗体表达载体(pMC-C_(H)、pMC-C_(L)),并经菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,并使用100μg/mL博来霉素(Zeocin)筛选,经有限稀释法将其克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与western blot筛选出同时表达鼠-猫重组重、轻链基因的细胞株并命名为CHO-MC,将CHO-MC上清中表达的嵌合抗体纯化后调整浓度为1 mg/mL,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。结果表明,经SDS-PAGE检测鼠-猫嵌合抗体重链和轻链大小分别为55 ku和25 ku,western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能够稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫IgG和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280(0.78μg/mL)和1:16(62.5μg/mL)。本研究首次通过哺乳动物细胞表达系统表达了FPV的嵌合抗体,对治疗FPV抗体类药物的研究具有重要指导意义。

关键词：基因工程嵌合抗体猫细小病毒哺乳动物表达系统

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CAML蛋白对流感病毒复制调控机制的初步研究

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中国预防兽医学报 2021年第2期43卷 115-120页

作者：孔凡迪王广文严娅温霞王倩赵玉辉梁立滨李俊平李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究宿主因子钙离子信号调节亲环素配体(CAML)调控流感病毒复制的机制,本研究通过siRNA干扰技术下调CAML的表达后,利用病毒蚀斑试验检测CAML对流感病毒复制的影响,利用激光共聚焦显微镜观察CAML对流感病毒NP蛋白入核的影响,通过流式... 详细信息

为探究宿主因子钙离子信号调节亲环素配体(CAML)调控流感病毒复制的机制,本研究通过siRNA干扰技术下调CAML的表达后,利用病毒蚀斑试验检测CAML对流感病毒复制的影响,利用激光共聚焦显微镜观察CAML对流感病毒NP蛋白入核的影响,通过流式细胞仪检测CAML对流感病毒诱导的细胞凋亡的影响。瞬时过表达CAML后,利用双荧光素酶报告基因试验检测CAML对流感病毒聚合酶活性的影响。通过qRT-PCR检测流感病毒感染后对CAML mRNA转录水平的影响。结果显示:下调表达CAML可显著抑制流感病毒的复制水平,但对流感病毒NP蛋白的入核无影响;瞬时过表达CAML对流感病毒聚合酶活性无影响;下调表达CAML能够促进流感病毒诱导的细胞凋亡过程,并且流感病毒感染能够导致CAML mRNA转录水平的逐渐降低。以上结果表明:CAML可能通过抑制细胞凋亡的方式促进流感病毒复制,而不是作用于流感病毒的侵入阶段以及转录复制阶段,并且流感病毒感染对CAML的表达具有下调作用。本研究初步探究了宿主因子CAML参与流感病毒复制的分子机制,为其的深入研究奠定了基础。

关键词： CAML 流感病毒复制细胞凋亡

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同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国预防兽医学报 2021年第5期43卷 501-506页

作者：刘本金郑亚婷许腾林姜骞刘家森康洪涛田进郭东春曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立可以同时检测多杀性巴氏杆菌(Pm)及其荚膜A型的快速敏感检测方法,本研究在建立的Pm kmt1基因的荧光定量PCR基础上,设计了该菌capA基因特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。本实验从荚膜... 详细信息

为建立可以同时检测多杀性巴氏杆菌(Pm)及其荚膜A型的快速敏感检测方法,本研究在建立的Pm kmt1基因的荧光定量PCR基础上,设计了该菌capA基因特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。本实验从荚膜A型Pm C48-1菌株中扩增了capA基因,构建了重组质粒pMDcapA;以pMD-capA重组质粒为标准品,建立的标准曲线在9.83×10^(3)拷贝/μL~9.83×10^(9)拷贝/μL内与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9873,扩增效率(E)为1.032。建立的双重荧光定量PCR方法可以同时检测Pm及其荚膜A型,而对B型、D型Pm、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等细菌检测结果均为阴性,具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测灵敏度为10^(1)拷贝/μL,高于常规PCR检测方法(10^(3)拷贝/μL)100倍具有较高的敏感性;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有较好的重复性。本实验建立的双重荧光定量PCR方法可以同时快速敏感地检测Pm及其荚膜A型,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。

关键词：多杀性巴氏杆菌 TaqMan探针荧光定量PCR

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