检索结果-内蒙古大学图书馆

基于SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系研究SYNJ2BP对EIAV复制的影响

中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1258-1262,1281页

作者：王欣慧段盈伊陈克伟王雪峰那雷杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为分析突触小泡磷酸酶2结合蛋白(SYNJ2BP)对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究设计了2条靶向SYNJ2BP基因外显子的特异性sgRNA,将sgRNA插入plenti-CRISPRv2GFP载体获得重组质粒pSYNsgRNA1和pSYN-sgRNA2,将这2个重组质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪分选获得单克隆细胞株,测序结果显示SYNJ2BP基因产生插入突变,经western blot确认已敲除SYNJ2BP基因并稳定遗传,表明获得了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系。将EIAV感染性克隆质粒CMV3-8分别转染SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系与野生型细胞,经western blot证实与野生型细胞相比敲除SYNJ2BP抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,灰度值显示囊膜蛋白表达量降低50%。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系,并发现SYNJ2BP基因敲除后抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,本研究为进一步分析SYNJ2BP调节EIAV复制的分子机制提供了参考依据。

关键词： CRISPR/Cas9 马传染性贫血病毒 SYNJ2BP HEK293T

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非洲猪瘟病毒p30蛋白的真核表达纯化及单克隆抗体的制备

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中国预防兽医学报 2021年第10期43卷 1074-1079页

作者：刘靖钟杰陈伟业王晗张经伟步志高华荣虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp... 详细信息

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp30)获得了表达。将表达rp30的细胞再经G418筛选并采用有限稀释法亚克隆后,采用IFA和western blot鉴定。IFA结果显示,经筛选获得的克隆细胞中有绿色荧光;western blot结果显示,克隆细胞在30 ku~38 ku出现3条特异性条带,表明获得了一株表达rp30的细胞ASFV-p30。表达的rp30利用镍柱亲和层析纯化并经western blot鉴定纯化效果后,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,经ELISA和亚克隆筛选MAb。获得的MAb经亚型试剂盒鉴定,并分别经IFA和western blot鉴定该MAb的反应性,采用间接ELISA方法检测MAb的腹水及细胞培养上清液效价,采用western blot检测该MAb与猪源病原ASFV、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的交叉反应性。结果显示,经ELISA和亚克隆筛选获得一株p30蛋白的MAb 13G2。亚型鉴定结果显示,该MAb重链为IgG1,轻链为κ型。IFA和western blot结果显示,该MAb与ASFV-p30细胞表达的p30蛋白有良好的反应原性。ELISA结果显示该MAb的腹水及培养上清效价分别为1.409600、1.1024。交叉反应性结果显示,仅ASFV感染的细胞与该MAb作用后出现特异性条带,而其他病原感染的细胞均无特异性条带,表明MAb 13G2的特异性较强。本研究首次利用哺乳动物细胞表达系统表达了ASFV p30蛋白,制备的蛋白更接近天然p30蛋白分子,以该蛋白制备的MAb用于检测ASFV更加准确,为ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速检测奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白真核表达单克隆抗体

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猫细小病毒适配体的筛选与鉴定

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 826-831页

作者：董丽丽许鑫燕刘迪郑亚婷康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27... 详细信息

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。

关键词：猫细小病毒适配体 SELEX技术

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MAVS^(-/-)细胞系的构建及其影响禽流感病毒复制的研究

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 344-350页

作者：张子博田璐史鑫琪郭慧娟陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MAVS基因稳定敲除的细胞株,对流感病毒的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向MAVS基因sgRNA表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,经过流式细胞仪分选、PCR、基因测序筛选MAVS敲除... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MAVS基因稳定敲除的细胞株,对流感病毒的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向MAVS基因sgRNA表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,经过流式细胞仪分选、PCR、基因测序筛选MAVS敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量PCR方法检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后的TCID_(50)、病毒拷贝数以及IRF3、IFN-β、Mx1基因转录水平变化。结果显示,筛选出1株MAVS基因缺失44 bp的MDCK细胞(MAVS^(-/-)MDCK),其增殖速度与正常细胞相比未观察到显著差异;荧光定量PCR结果表明,TCID_(50)、病毒拷贝数差异最高可分别达到MDCK细胞的4.11倍和1.82倍;MAVS^(-/-)MDCK中IRF3、IFN-β和Mx1 m RNA表达水平显著降低,表明MAVS敲除后抑制了Ⅰ型干扰素信号通路。表明,本研究获得的MAVS^(-/-)MDCK能够促进禽流感病毒的复制,为提高疫苗生产效率和质量提供候选细胞株;该细胞株也为进一步研究MAVS参与抗病毒天然免疫应答奠定基础。

关键词： MAVS MDCK CRISPR/Cas9 H9N2亚型禽流感病毒

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紫外线抵抗相关基因UVRAG影响狂犬病病毒感染机制的研究

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 812-819页

作者：何倩倩王鑫鑫罗杰温志远王金良步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并... 详细信息

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并绘制病毒的生长曲线。结果显示,与转染对照siControl的细胞相比,干扰UVRAG的表达再感染RABV后不同时间细胞上清中的病毒滴度均显著降低(p<0.01),表明干扰UVRAG的表达后抑制RABV的复制能力;而过表达UVRAG后则不影响RABV的增殖能力。干扰293细胞中UVRAG的表达后分别感染表达RABV G蛋白的重组VSV(rERA-G-VSV)及VSV,6 h后利用q PCR方法检测各细胞中的病毒拷贝数。结果显示,与未干扰的细胞相比,干扰UVRAG表达后细胞中rERA-G-VSV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但干扰或者未干扰细胞中VSV基因拷贝数则无显著差别。表明RABV G蛋白是rERA-G-VSV在干扰UVRAG表达细胞中增殖下降的原因且UVRAG影响RABV感染的早期侵入阶段。干扰293细胞中UVRAG表达后感染rERAmCherry,利用酸绕过试验进一步分析RABV感染的阶段;上述干扰细胞感染rERA-mCherry后不同时间点(0、1.5 h、6 h)利用qPCR方法检测病毒基因拷贝数,分析UVRAG影响RABV侵入的具体阶段。酸绕过试验结果显示,经pH7.5的PBS处理后,干扰组的细胞相对于未干扰组细胞中RABV基因拷贝数极显著下降(p<0.001);但pH5.5的酸性PBS处理后两组转染细胞中的病毒拷贝数无显著差异。进一步证明UVRAG在RABV感染早期的侵入阶段发挥重要作用。不同时间点病毒基因拷贝数的qPCR检测结果显示,病毒感染后0、1.5 h两种转染细胞中的病毒拷贝数均无显著差异,但在感染病毒6 h时干扰组的细胞相比于未干扰组的细胞中病毒的拷贝数显著降低(p<0.01)。表明UVRAG影响病毒的胞内运输阶段。利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测UVRAG及其不同结构域蛋白与RABV受体一代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)的相互作用关系,结果显示UVRAG的N端aa1~aa147与mGluR2存在特异性的相互作用。以上结果表明,UVRAG影响RABV的胞内运输可能与其和mGluR2的互作相关。本研究初步揭示了UVRAG在RABV感染中的作用,为RABV侵入机制的揭示奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒紫外线抵抗相关基因胞内运输代谢型谷氨酸受体2

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基于非洲猪瘟病毒CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2021年第5期41卷 847-852页

作者：韩玉王涛潘力孙茂文周萍萍王冰王翌罗玉子仇华吉孙元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因... 详细信息

为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因为靶标的能够鉴别ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.6×101~1.6×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R^(2)为0.998;该方法可以特异性检测ASFV,不与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型发生交叉反应;最低检测限为16拷贝/μL,比常规PCR的敏感性高出3个数量级;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%;能够有效地区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株;该方法与本实验室建立的针对ASFV p72基因的荧光定量PCR方法在检测临床样品时无统计学差异且符合率高。本研究所建立的TaqMan荧光定量PCR方法为ASFV的快速检测提供了新靶标,同时也为ASFV CD2v基因功能的研究、野毒株与CD2v基因缺失毒株的鉴别提供了有力的技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 CD2v基因荧光定量PCR 鉴别诊断

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NDV或H9N2 AIV感染对坦布苏病毒继发感染宿主单核-巨噬细胞的影响

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黑龙江畜牧兽医 2022年第19期 15-22,139页

作者：张艳慧马勇梁雨萌崔露陈志杰李雪峰胥利刘柘一刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队/国家禽类实验动物资源库哈尔滨150069

为研究新城疫病毒(NDV)或H9N2禽流感病毒(AIV)对坦布苏病毒(TMUV)继发感染宿主单核-巨噬细胞的影响及其潜在机制,试验通过实时荧光定量PCR方法检测NDV或H9N2 AIV预先感染鸭单核-巨噬细胞和HD11细胞后再感染TMUV 12,24小时时的TMUV基因... 详细信息

为研究新城疫病毒(NDV)或H9N2禽流感病毒(AIV)对坦布苏病毒(TMUV)继发感染宿主单核-巨噬细胞的影响及其潜在机制,试验通过实时荧光定量PCR方法检测NDV或H9N2 AIV预先感染鸭单核-巨噬细胞和HD11细胞后再感染TMUV 12,24小时时的TMUV基因组拷贝数,分析是否可用HD11细胞替代鸭单核-巨噬细胞进行后续试验;分别通过高分辨率活细胞共聚焦显微镜和ELISA检测NDV和H9N2 AIV感染12,24 h对HD11细胞中活性氧(ROS)和Ⅰ型干扰素(IFN)含量的影响;通过实时荧光定量PCR方法分别检测PMA、外源Ⅰ型IFN与细胞共孵育后,感染TMUV 12,24小时时ROS和24小时时Ⅰ型IFN对TMUV基因组在细胞中复制的影响。结果表明:感染12,24小时时,在鸭单核-巨噬细胞中,NDV混合感染组的TMUV基因组拷贝数极显著低于TMUV单独感染组(P<0.01);感染12,24小时,H9N2 AIV混合感染组的TMUV基因组拷贝数分别显著和极显著低于TMUV单独感染组(P<0.05,P<0.01)。在HD11细胞中,NDV混合感染组的TMUV基因组拷贝数分别显著和极显著低于TMUV单独感染组(P<0.05,P<0.01);H9N2 AIV混合感染组的TMUV基因组拷贝数极显著低于TMUV单独感染组(P<0.01)。感染12,24小时时,NDV和H9N2 AIV均可极显著提高HD11细胞中ROS的含量(P<0.01)。感染24小时时,NDV可显著提高IFN-α的含量(P<0.05),感染12,24小时时,NDV可极显著提高IFN-β的含量(P<0.01);H9N2 AIV可在感染12,24小时时极显著提高IFN-β的含量(P<0.01)。ROS可在感染TMUV 12,24小时时极显著抑制TMUV基因组的复制(P<0.01),Ⅰ型IFN可在感染TMUV 24小时时显著抑制TMUV基因组的复制(P<0.05)。说明可用HD11细胞替代鸭单核-巨噬细胞进行后续试验;在鸭单核-巨噬细胞中,NDV或H9N2 AIV感染均可以有效抑制TMUV基因组的复制,其作用可能是通过提高ROS和Ⅰ型IFN含量实现的。

关键词：坦布苏病毒新城疫病毒 H9N2禽流感病毒混合感染单核-巨噬细胞

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结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结晶及其对分枝杆菌致病性的影响

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黑龙江畜牧兽医 2022年第11期 16-20,25,134页

作者：唐阳阳李华芳邵明珠藏鑫鑫崔子寅陈利苹党光辉刘思国吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队哈尔滨150069

为了研究结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结构、黏附途径及其在分枝杆菌致病过程中的作用,试验通过亲和层析法纯化Rv0394c蛋白,然后使用蛋白结晶筛选试剂盒筛选蛋白质结晶条件,通过亚细胞定位确定Rv0394c蛋白在分枝杆菌中的定位;通过激... 详细信息

为了研究结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结构、黏附途径及其在分枝杆菌致病过程中的作用,试验通过亲和层析法纯化Rv0394c蛋白,然后使用蛋白结晶筛选试剂盒筛选蛋白质结晶条件,通过亚细胞定位确定Rv0394c蛋白在分枝杆菌中的定位;通过激光共聚焦显微镜观察Rv0394c蛋白与A549细胞的黏附情况;随后进行重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)与A549细胞的黏附和黏附阻断试验并计数肺脏荷菌数;用重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)滴鼻感染小鼠,在不同感染时间分别摘取肺脏观察病理变化并进行荷菌数计数。结果表明:成功获得Rv0394c蛋白。Rv0394c蛋白浓度为8 mg/mL时,在0.15 mol/L二水氯化钙-0.1 mol/L三水醋酸钠-pH值为4.6-15%异丙醇条件下,Rv0394c蛋白出现单晶生长。Rv0394c蛋白为胞外蛋白且能通过透明质酸(HA)黏附于A549细胞表面;与pMV262_Ms相比,Rv0394c_Ms黏附于A549细胞的数量极显著增加(P<0.01),用Rv0394c蛋白、HA和兔抗Rv0394c多克隆抗体处理的Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数(P<0.01)。在感染小鼠第4,8,14天,Rv0394c_Ms组在肺脏中的荷菌数极显著高于pMV262_Ms组(P<0.01);在第8天,Rv0394c_Ms组荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms+HA组(P<0.01)。Rv0394c蛋白能诱导小鼠肺脏的病理损伤。说明黏附蛋白Rv0394c是通过透明质酸黏附于肺脏上皮细胞参与分枝杆菌致病过程的。

关键词：分枝杆菌黏附蛋白 Rv03914c 结晶致病性细胞黏附

来源：评论

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融合域点突变的埃博拉病毒GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价

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中国预防兽医学报 2021年第2期43卷 171-177页

作者：张海琳王金良王翀温志远刘任强步志高葛金英中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室队黑龙江哈尔滨150069

扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90%,对公共卫生构成严重威胁。EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白。本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋... 详细信息

扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90%,对公共卫生构成严重威胁。EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白。本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋白的重组病毒rLa-EBOVGP改变了NDV的侵入方式。为了研制出安全性更高的埃博拉候选疫苗株,本研究将EBOV GP蛋白的融合域I532突变为R后插入NDV LaSota疫苗株(rLa)基因组中,通过反向遗传学操作拯救表达EBOV GP(I532R)蛋白的重组NDV,并将经PCR鉴定正确的重组病毒在鸡胚中连续传代检测了其的体外遗传稳定性。RT-PCR鉴定结果显示,EBOV突变的GP(I532R)蛋白基因正确插入了NDV基因组中,表明获得了重组病毒rLa-EBOVGP(I532R);在鸡胚中连续传20代后,经RT-PCR扩增EBOV GP(I532R)基因后经测序鉴定,结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够保持良好的遗传稳定性。利用蔗糖梯度超速离心法纯化rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)病毒,分别进行western blot检测。结果显示,EBOV GP和GP(I532R)蛋白均能够正确表达;将rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)分别感染BHK-21细胞后,利用激光共聚焦试验分析EBOV GP(I532R)的表达和定位,结果显示GP(I532R)能够表达且位于BHK-21细胞的细胞膜上;对纯化病毒利用免疫电镜观察病毒颗粒,结果可见rLa-EBOVGP(I532R)与亲本病毒rLa结构特征相似,且GP(I532R)蛋白能够嵌合在重组病毒粒子表面;生长动力学试验结果表明,rLa-EBOVGP(I532R)与亲本株rLa在鸡胚中的生长特性基本一致,且能够稳定增殖;分别将重组病毒rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I532R)经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫小鼠,经稀释血清固定病毒的方法分别检测各组小鼠针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。结果显示rLa-EBOVGP(I532R)能够诱导小鼠产生较高的针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。以上结果表明rLa-EBOVGP(I532R)具有作为防控EBOV感染的储备性候选疫苗株的潜力。本研究为进一步研究GP(I532R)的生物学功能奠定了基础。

关键词：扎伊尔型埃博拉病毒囊膜蛋白突变重组新城疫病毒

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EIAV Rev核输出活性检测系统的建立

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 86-90页

作者：张萌萌高敏张相敏王雪峰王晓钧吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性。为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附... 详细信息

Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性。为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev的核输出活性检测方法,本研究通过PCR方法克隆了EIAV的结构蛋白Gag-Pol编码区序列及Rev反应元件(RRE)序列,构建pGagpol-RRE表达载体,将其单独或与Rev表达载体(pcDNA-Rev _(FDDV)-HA)共转染HEK293T细胞后,通过western blot分析显示,pGagpol-RRE单独转染HEK293T细胞不表达,须在Rev的作用下才能在HEK293T细胞中表达,而且Gag的表达量随着Rev剂量(0.05μg、0.1μg、0.2μg)的增加而增加。在pcDNA-Rev _(FDDV)-HA的基础上,通过PCR方法将Rev核输出活性的关键位点L^(36)突变成A,构建突变的Rev表达载体pcDNA-Rev _(L36A)-HA,将其与pGagpol-RRE共转染HEK293T细胞后,经western blot检测结果显示,未检测到Gag的表达。上述结果表明表达载体pGagpol-RRE可以用于评价EIAV Rev的核输出活性。在此基础上,本研究将不同EIAV的Rev表达载体与pGagPol-RRE共转染HEK293T细胞,经western blot鉴定结果显示,不同EIAV的Rev均可以介导Gag-Pol的表达。上述结果表明,表达载体pGagpol-RRE转染细胞后经western blot检测Gag表达量的变化可以广泛用于评价不同EIAV Rev的核输出活性。本研究利用Rev与RRE结合介导Gag-Pol表达的原理首次建立了EIAV Rev核输出活性检测系统,为进一步研究Rev的生物学活性奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒病毒蛋白表达调节因子核输出活性 Rev反应元件

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