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中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会

作者：于康震付朝阳崔尚金步志高唐秀英中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心

动物流感研究中心的成立有力地推动了我国禽流感的防制研究工作。本文将就我国在禽流感疫情调查、诊断和监测、病毒分离鉴定、疫苗免疫、病毒分子生物学等诸多方面的研究现状作一简要综述。

关键词：禽流感防制进展

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表达禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

表达禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十次学术研讨会

作者：贾永清乔传玲中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心(哈尔滨) 东北农业大中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室(哈尔滨)

将AIV广东分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因正向克隆于pSY538的EcoR I 位点，将LacZ报告基因插入Sma I位点，然后切取含外源基因和报告基因的Not I片段克隆于pSY681的Not I位点，构建AIV HA基因重组禽痘病毒转移载体，经酶切... 详细信息

将AIV广东分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因正向克隆于pSY538的EcoR I 位点，将LacZ报告基因插入Sma I位点，然后切取含外源基因和报告基因的Not I片段克隆于pSY681的Not I位点，构建AIV HA基因重组禽痘病毒转移载体，经酶切分析和PCR鉴定后，利用脂质转染试剂盒在鸡胚成纤维细胞上与F-017禽痘病毒弱毒苗株进行共转染。经重组病毒筛选与纯化，获得遗传性状稳定的AIV HA基因重组禽痘病毒。

关键词：基因重组血凝素禽痘病毒

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H3N8亚型禽流感病毒分离株与变异株的生物学特性

H3N8亚型禽流感病毒分离株与变异株的生物学特性

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中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会

作者：崔尚金于康震唐秀英刘明田国彬刘尚高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业大学动物医学院

本研究对分离到的H3N8禽流感病毒分离株A/Chick/Jilin/98(J1株)和其传代过程中发生变异的变异株(J2株)进行了生物学和病理学特性的初步研究,发现在相同的时间内,J1株病毒致死鸡胚数量明显高于J2株病毒,病毒HA的滴度也明显高于J2株;J1株... 详细信息

本研究对分离到的H3N8禽流感病毒分离株A/Chick/Jilin/98(J1株)和其传代过程中发生变异的变异株(J2株)进行了生物学和病理学特性的初步研究,发现在相同的时间内,J1株病毒致死鸡胚数量明显高于J2株病毒,病毒HA的滴度也明显高于J2株;J1株的IPVI为1.44,而J2为0.64;毒株的致病性试验与SPF感染鸡的器官变化表明J1组的病理学变化较J2组明显,且嗜器官为肺、肝、法氏囊、胸腺、脾等主要的免疫器官;本研究还对SPF感染鸡的病变器官进行了病原学检测、病理组织检测和电镜观察。结果表明两者存在较明显的差异。

关键词：禽流感病毒 H3N8 生物学特性

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流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 177-页

作者：刘明于康震张云孔宪刚徐宜为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因，将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点，筛选到阳性重组子ｐＵＣＨ５。然后将ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移... 详细信息

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因，将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点，筛选到阳性重组子ｐＵＣＨ５。然后将ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ，筛选到重组转移载体ｐＢａｃＨ５。经过序列分析证明阅读框架正确后，在脂质体转染试剂介导下，ｐＢａｃＨ５与线性化的杆状病毒ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化，获得纯化的重组杆状病毒ｒＢａｃＨ５。提取重组杆状病毒ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验结果表明ＨＡ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的ＨＡ蛋白能够凝集公鸡红细胞，血凝价１２８０－２５６０ＨＡＵ／ｍｌ。ＨＡ蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达，为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：流感病毒血凝素基因杆状病毒表达

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编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 11-页

作者：张宝山孙成群刘相冬刘永刚周家喜王凯波刘建华孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

ＥＩＡＶ在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节，其中Ｒｅｖ蛋白是病毒编码的转录后调节因子，决定了病毒复制由早期到晚期的过渡。Ｒｅｖ是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬... 详细信息

ＥＩＡＶ在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节，其中Ｒｅｖ蛋白是病毒编码的转录后调节因子，决定了病毒复制由早期到晚期的过渡。Ｒｅｖ是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在病毒繁殖早期提取细胞总ＲＮＡ，反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析，和与基因组全序列的比较，确定了编码Ｒｅｖ蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。

关键词： EIAV核输出因子蛋白 cDNA克隆序列测定

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编码EIAV反式激活蛋白Tat的cDNA克隆和序列测定

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 93-页

作者：张宝山孙成群刘相冬刘永刚周家喜王凯波刘建华孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

ＥＩＡＶ在繁殖过程中的转录涉及到多种因子的调节，其中ＴＡＴ蛋白是病毒编码的反式激活因子，是病毒复制必须成分。ＴＡＴ是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在... 详细信息

ＥＩＡＶ在繁殖过程中的转录涉及到多种因子的调节，其中ＴＡＴ蛋白是病毒编码的反式激活因子，是病毒复制必须成分。ＴＡＴ是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在病毒增殖早期提取细胞总ＲＮＡ，反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析，和与基因组全序列的比较。确定了编码ＥＩＡＶ反式激活蛋白的转录产物及阅读框架及转录后拼接位点，研究发现至少有两种拼接产物编码ＴＡＴ。

关键词：

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马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 175-页

作者：王柳杨志彪刘红全智海东仇华吉童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ，这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组，ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接，获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组... 详细信息

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ，这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组，ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接，获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒，将其命名为ｐ８．０。将此８．０ＫｂＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整ＥＩＡＶＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中，获得一含有ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒，将其命名为ｐ８．２，经核苷酸序列分析，证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞，将其作为种毒进行传代，于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶，说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后，第４天出现病变，经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子，进一步证明ｐ８．２具有感染性，我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆，为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克降

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表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因的DNA疫苗可保护SPF鸡抵抗同型病毒的致死性攻击

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 173-页

作者：姜永萍姜永萍陈化兰陈化兰于康震于康震张建林张建林步志高唐秀英田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心哈尔滨150001

将高致病力禽流感病毒分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（ＨＳＮ１）（ＧＤ／１／９６）的ＨＡ基因ｃＤＮＡ片段克隆于强启动子ＣＭＶ下游，构建了ＤＮＡ疫苗质粒ｐＣＩＨ５，对其免疫保护性进行了三批不同层次的... 详细信息

将高致病力禽流感病毒分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（ＨＳＮ１）（ＧＤ／１／９６）的ＨＡ基因ｃＤＮＡ片段克隆于强启动子ＣＭＶ下游，构建了ＤＮＡ疫苗质粒ｐＣＩＨ５，对其免疫保护性进行了三批不同层次的动物保护试验。试验Ｉ分为两部分，第一部分为ｐＣＩＨ５一次免疫组（１０μｇ、４０μｇ、７０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ）、油苗组及空白对照组，第二部分为ｐＣＩＨ５两次免疫组（５μｇ、２０μｇ、３５μｇ、５０μｇ）及其对照组，ｐＣＩＨ５以２００μｌ腿肌两点注射，一次免疫组于免疫后３周以１０ＬＤ５０ＣＤ／１／９６攻毒，两次免疫组首免后３周加强免疫一次，二免后２周以５０ＬＤ５０ＣＤ／１／９６攻毒，免疫及攻毒前后均采血检测ＨＩ抗体和ＡＧＰ抗体，攻毒后７天采集泻殖腔棉拭子分离病毒。试验Ⅱ分为５０μｇ和１００μｇ（１００μｌ）两次免疫组及对照组，攻毒剂量为１０ＬＤ５０ＣＤ／１／９６。试验Ⅲ为试验Ⅱ的重复试验，但免疫注射体积为２００μｌ。结果，三批试验的所有对照鸡在攻毒后２－８天全部死亡；试验Ⅰ中１０μｇ、４０μｇ、７０μｇ、１００μｇ和１５０μｇｐＣＩＨ５一次免疫，但免疫保护率分别为１２．５％（１／８?

关键词：禽流感病毒血凝索基因 DNA疫苗免疫保护

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禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护性

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 179-页

作者：马文军马文军陈化兰陈化兰于康震于康震张建林张建林田国彬唐秀英中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心哈尔滨150001

以脂质体转染技术构建了表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组鸡痘病毒ｒＦＰＶ－ＨＡ，该病毒在鸡胚成纤维细胞内能稳定产生子代病毒，经翅皮下５Ｘ１０５ＰＦＵ／羽免疫８周龄ＳＰＦ鸡，免疫后第３周用１００ＥＬ... 详细信息

以脂质体转染技术构建了表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组鸡痘病毒ｒＦＰＶ－ＨＡ，该病毒在鸡胚成纤维细胞内能稳定产生子代病毒，经翅皮下５Ｘ１０５ＰＦＵ／羽免疫８周龄ＳＰＦ鸡，免疫后第３周用１００ＥＬＤ５０的ＨＡ基因同源ＡＩＶＡ／ＡｒｆｉＳｔａｒ／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９（Ｈ７Ｎ１）进行人工感染。１周后用棉拭子于泄殖腔取样，进行病毒分离。免疫后第３周及攻毒后第１、２周对所有动物进行翅静脉采血，检测血凝抑制（ＨＩ）抗体和免疫沉淀（ＡＧＰ）抗体。结果，攻毒前重组病毒免疫组可检测到很低的ＨＩ抗体，检测不到ＡＧＰ抗体，野生型病毒（Ｆ０１７）接种组和空白对照组ＨＩ抗体和ＡＧＰ抗体均为阴性。攻毒后重组病毒免疫组的ＨＩ抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组。重组病毒免疫组有６／８的鸡为流感病毒分离阴性，野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性。这些结果表明我们所构建的表达Ｈ７亚型ＡＩＶ　ＨＡ基因的重组鸡痘病毒可诱导鸡产生有效的免疫保护反应，肠道排毒显著减少。同时也表明，重组禽痘病毒可作为一种预防禽流感候选标记疫苗，藉此可望较好地解决全病毒灭活疫苗成本高和疫苗免疫鸡与自然感染鸡?

关键词：禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒

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禽流感病毒NP cDNA反义逆转录病毒载体的构建及重组病毒的鉴定

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中国预防兽医学报 2000年第S1期22卷 146-页

作者：孟庆文邓国华曹素芳乔传玲于康震田国斌唐秀英中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 新疆农业大学

根据反义ＲＮＡ作用原理，以禽流感病毒（ＡＩＶ）Ｈ１４Ｎ５　ｃＤＮＡ全长及５’端２３５个ｂｐ为目的基因，反向插入反转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，命名为ｐＬＸＳＮ－ＮＰ及ｐＬＸＳＮ－ＮＰ，用脂质体包裹重组质粒转染包装细胞 ... 详细信息

根据反义ＲＮＡ作用原理，以禽流感病毒（ＡＩＶ）Ｈ１４Ｎ５　ｃＤＮＡ全长及５’端２３５个ｂｐ为目的基因，反向插入反转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，命名为ｐＬＸＳＮ－ＮＰ及ｐＬＸＳＮ－ＮＰ，用脂质体包裹重组质粒转染包装细胞ＰＡ３１７，Ｇ４１８筛选抗性克性，扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒ＲＮＡ（ｖＲＮＡ），以巢式ＰＣＲ方法检测，以及用包装细胞上清（重组病毒）感染滴定细胞系ＮＩＨ３Ｔ３，表明已筛选出产毒的的克隆细胞质，得到重组逆转录病毒，为反义ＲＮＡ抑制禽流感病毒复制的实验研究奠定了物质基础。

关键词：反义RNA 禽流感病毒逆转录病毒载体巢式PCR

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