检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 963-969页

作者：刘学敏张元峰王永琦康力黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)E301R蛋白单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化了重组E301R蛋白(r E301R)。将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E301R蛋白MAb的杂交瘤细胞株8B3,亚类鉴定结果显示8B3 MA... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)E301R蛋白单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化了重组E301R蛋白(r E301R)。将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E301R蛋白MAb的杂交瘤细胞株8B3,亚类鉴定结果显示8B3 MAb为IgG1型。利用一系列表达部分重叠的重组E301R片段并经western blot鉴定8B3 MAb识别的抗原表位,结果显示,8B3 MAb识别的抗原表位为^(1)MSEDIRRGPGRPPKKRVVPN。采用western blot检测制备的8B3 MAb与HEK293T细胞中过表达的E301R蛋白(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的E301R蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测8B3 MAb与293T细胞中过表达的E301R蛋白的反应性及E301R蛋白在细胞中的定位。Western blot结果显示,过表达E301R蛋白的293T细胞出现了36 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAM中(感染后8 h)出现了36 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加。IFA结果显示,在过表达E301R蛋白的293T细胞中出现绿色荧光,且其定位于细胞质中。以上结果表明,制备的8B3MAb既能够与过表达的E301R蛋白,也能够与天然表达的E301R蛋白反应,反应性较强。将8B3 MAb用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的E301R蛋白和Flag-Agarose结合后与8B3 MAb的反应性。结果显示,8B3 MAb可以检测到结合在Flag-Agarose上的E301R蛋白,出现约36 ku的特异性条带。表明8B3 MAb可以用于Co-IP试验。这些研究结果为进一步研究E301R蛋白的功能奠定实验基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 E301R蛋白单克隆抗体抗原表位

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适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立

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畜牧兽医学报 2023年第10期54卷 4311-4319页

作者：谢青云易玮婕李嘉豪白昀谢星袁厅张越冯余凡赵东明步志高刘斐冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院单分子纳米生物学实验室南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的AS... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体量子点免疫试纸条现场即时检验

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2016~2021年我国猪伪狂犬病病毒的分子流行病学调查与分析

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中国预防兽医学报 2023年第2期45卷 122-128,155页

作者：郭镇洋赵静付军许浒李超李宛生孙琪裴艳艳龚帮俊王倩周国辉汤艳东冷超粮王永杰陈长青安同庆蔡雪辉张洪亮田志军彭金美中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 南阳师范学院河南南阳473061 河北省威远药业有限公司河北石家庄052165

为探究近几年猪伪狂犬病病毒(PRV)在我国的流行情况及遗传演化特征,本研究对2016年~2021年采自全国17个省、市和自治区的2299份临床样品经PCR检测,并利用PCR扩增阳性样品中的PRV gB、gE和gC基因并测序,采用MegAlign分析三者与GenBank登... 详细信息

为探究近几年猪伪狂犬病病毒(PRV)在我国的流行情况及遗传演化特征,本研究对2016年~2021年采自全国17个省、市和自治区的2299份临床样品经PCR检测,并利用PCR扩增阳性样品中的PRV gB、gE和gC基因并测序,采用MegAlign分析三者与GenBank登录的PRV参考株相应基因序列的同源性;利用MEGA 7.0分别构建上述3个基因的遗传进化树,并采用MegAlign分析gB、gE和gC蛋白氨基酸序列的差异,分析其遗传演化及分子特征的变化。结果显示,共扩增出24份PRV阳性样品,阳性率约1.04%,且不同年份及不同地区均有PRV的检出。PRV gB、gE和gC基因序列的同源性及遗传进化分析结果显示,3个基因及其编码氨基酸序列均与2011年以来的PRV变异株同源性最高,且均属于基因Ⅱ型PRV变异株;氨基酸序列比对结果显示,与基因Ⅰ型PRV相比,所测PRV gB、gE和gC中均存在特征性氨基酸突变位点:gB氨基酸序列aa75~aa77连续缺失3个氨基酸(SPG),aa93~aa94连续插入2个氨基酸(DG);gE氨基酸序列在aa48和aa496各插入1个氨基酸(D);gC氨基酸序列在aa63~aa69连续插入7个氨基酸AAASTPA。此外,本研究通过比对国内外经典株以及2011年以来国内PRV gE蛋白的氨基酸序列,确定了不同亚型PRV(即指基因Ⅱ型PRV变异株和经典株)的分子特征即基因Ⅱ型PRV变异株:gE aa496为“D+”或aa496为“D-”+aa448“I”;基因Ⅱ型PRV经典株:gE为aa496“D-”+aa448“V/A”。上述结果表明,我国现阶段仍以基因Ⅱ型PRV变异株的流行为主,进一步明确了不同基因型和亚型PRV的分子特征,对了解我国PRV的流行现状及当前流行株的分子特征具有重要意义,为PRV诊断试剂的研发及PR的防控提供了参考。

关键词：猪伪狂犬病病毒变异株遗传演化分子特征

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趋化因子CCL26 C端截短肽的抗菌活性及抗生物被膜作用的研究

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 642-647页

作者：张会会昝亚楠金明洁梁思宇刘思国谢芳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为探究趋化因子CCL26 C端截短肽(26C)的生物学活性,本研究利用倍比稀释法测定了不同浓度的26C对耐多粘菌素B(PxB)大肠杆菌K1的浓度-杀菌曲线;利用外膜通透性试验(NPN)测定26C对细菌外膜的破坏效果;利用ATP泄露试验测定26C对细菌内容物... 详细信息

为探究趋化因子CCL26 C端截短肽(26C)的生物学活性,本研究利用倍比稀释法测定了不同浓度的26C对耐多粘菌素B(PxB)大肠杆菌K1的浓度-杀菌曲线;利用外膜通透性试验(NPN)测定26C对细菌外膜的破坏效果;利用ATP泄露试验测定26C对细菌内容物泄露的影响;利用透射电镜观察26C作用于细菌细胞膜后对菌体及内容物的影响;利用结晶紫染色法和激光共聚焦试验测定26C对铜绿假单胞菌生物被膜(BF)形成的影响;利用溶血活性试验检测26C对人红细胞的溶血活性,并利用MTT法测定其对人表皮角质形成细胞HaCaT的细胞毒性。结果显示,26C在不同浓度下对K1均有良好的杀菌活性,4μmol/L时可以完全杀灭细菌,使活菌数降低4log;26C(2μmol/L)通过破坏细菌细胞膜完整性并导致细菌内容物泄露而杀死细菌;低浓度的26C(1μmol/L)即可显著降低BF的形成;其在高达128μmol/L的浓度下对Ha Ca T细胞仍无溶血活性,且在1μmol/L~16μmol/L浓度对Ha Ca T细胞无毒性,其在32μmol/L~64μmol/L时对Ha Ca T细胞的毒性较低。本研究首次证实了CCL26 C端截短肽26C具有良好的抗菌活性和抗BF形成的能力,又无溶血活性和细胞毒性,为其作为新型药物的临床研究和应用提供数据参考。

关键词：趋化因子抗菌肽耐药抗菌活性

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PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

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微生物学通报 2022年第12期49卷 5100-5111页

作者：陈见兴王豪杰潘喻刘弘毅林欢朱良全陈洪岩谢金鑫夏长友张贺王玉娥新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 中国兽医药品监察所北京102600

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。

关键词：猪丁型冠状病毒新型猪急性腹泻综合征冠状病毒塞内卡病毒A型三重RT-PCR

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猪链球菌2型05ZYH33糖苷水解酶SSU05_1921和SSU05_1922的表达纯化及功能研究

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 269-276页

作者：卫东高广娟武柳君朱金鲁刘思国刘冉张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株高甘露糖型N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型N-聚糖水解酶SpGH92和EndoD同源的蛋白,分别为SSU05_1921(后简写为1921)和SSU05_1922(后... 详细信息

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株高甘露糖型N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型N-聚糖水解酶SpGH92和EndoD同源的蛋白,分别为SSU05_1921(后简写为1921)和SSU05_1922(后简写为1922)。本研究通过原核表达系统和Ni-NTA柱亲和层析纯化,获得了1921和1922全长蛋白,以及1922蛋白的糖苷水解酶结构域1922-Cat。通过6个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加1921和1922的蛋白反应2、3,同时加入1921和1922的蛋白反应4、5及同时加入1921和1922-Cat的蛋白反应6)的RNase B去糖基化试验,反应结束后分别通过SDS-PAGE及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析RNase B的水解(即去糖基化)产物,研究1921和1922水解高甘露糖型N-聚糖的功能。结果显示,1921为外切α-1,2-甘露糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖末端的α-1,2-甘露糖苷键;1922为内切β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖中的几丁二糖,作用位点为β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键。且只有在1921去除所有的α-1,2-甘露糖苷键,1922才能彻底水解高甘露糖型N-聚糖。二者的联合作用(反应4)结果显示,在15 ku处出现单一条带,表明二者联合作用于RNase B的高甘露糖型N-聚糖后,将其彻底去糖基化为R-GlcNAc,且1921与1922-Cat的联合作用与上述联合作用结果一致,表明1922的主要催化结构域即为1922-Cat。因此选择1921与1922-Cat联合作用于RNase B的去糖基化反应研究不同pH、不同金属离子及EDTA和EGTA螯合物对该联合作用的影响。结果显示,该联合作用的最适pH为7.0~8.0,二价金属离子Cu^(2+)、Fe^(2+)、Ni^(2+)、Co^(2+)、Zn^(2+)均明显抑制1921与1922-Cat的联合作用,Ca;部分抑制该联合作用,而二价离子Mg;、Mn;和一价离子K^(+)、Na^(+)及二价金属离子螯合物EDTA和EGTA对该联合作用无明显抑制作用,表明1921和1922-Cat的联合作用不依赖于二价金属离子。本研究首次较详细探究了SS2高甘露糖型N-聚糖水解酶的功能和生化特性,为解析SS定植和感染过程中糖类营养物质获取的机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型05ZYH33 SSU05_1921 SSU05_1922 糖苷水解酶高甘露糖型N-聚糖

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细胞hnRNP M蛋白与病毒基因组相互作用对塞内卡病毒复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 263-268,283页

作者：曹志远魏丹丹王海伟孙超于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究核不均一核糖核蛋白M(hnRNP M)在塞内卡病毒(SVA)复制过程中的作用,本研究构建了重组质粒pCAGGS-HA-hnRNP M,将该重组质粒转染至BHK-21细胞后经western blot检测,结果显示其可在细胞中正确表达hnRNP M蛋白。通过在BHK-21细胞中转... 详细信息

为研究核不均一核糖核蛋白M(hnRNP M)在塞内卡病毒(SVA)复制过程中的作用,本研究构建了重组质粒pCAGGS-HA-hnRNP M,将该重组质粒转染至BHK-21细胞后经western blot检测,结果显示其可在细胞中正确表达hnRNP M蛋白。通过在BHK-21细胞中转染pCAGGS-HA-hnRNP M过表达或转染shRNA-hnRNP M敲低hnRNP M表达后感染SVA,利用western blot检测SVA结构蛋白VP2和病毒TCID50,分析hnRNP M对SVA复制的影响,结果显示,与对照组比较,过表达hnRNP M蛋白可极显著抑制SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01),而敲低hnRNP M蛋白能极显著促进SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01)。进一步利用RNA免疫共沉试验在SVA感染的BHK-21细胞中获得免疫沉淀复合物,提取其RNA后利用SVA基因组特异性引物进行PCR检测,结果显示宿主细胞hnRNP M蛋白和SVA基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验检测SVA基因组和hnRNP M的定位情况,结果显示SVA感染宿主细胞后hnRNP M从细胞核转移至细胞质中,并与SVA基因组RNA在细胞质中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验分别在过表达hnRNP M和敲低hnRNP M的细胞中检测SVA内部核糖体进入位点(IRES)的活性,结果显示过表达hnRNP M蛋白能够抑制SVA IRES介导的翻译活性,而下调hnRNP M蛋白的表达则能够促进IRES的活性。上述研究结果首次证实了宿主细胞蛋白hnRNP M与SVA基因组存在相互作用,其可通过抑制IRES的翻译活性进一步抑制SVA复制。本研究为深入研究SVA复制的分子调控机制奠定了基础。

关键词：塞内卡病毒内部核糖体进入位点核不均一核糖核蛋白M 抑制作用

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基于单个B细胞抗体基因扩增技术筛选马IgG1单克隆抗体

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中国生物工程杂志 2022年第4期42卷 17-23页

作者：陈阳刘彤张佳琦廖化新林跃智王晓钧王亚玉暨南大学生命科学技术学院广州510632 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队哈尔滨150069

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选... 详细信息

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选。首先,将马IgG蛋白(EqIgG1-C)密码子优化后合成到真核表达载体pcDNA3.4上,纯化出抗原蛋白。随后,使用蛋白质免疫小鼠,分离脾细胞后利用流式细胞术分离特异性单个B细胞,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,用overlapping PCR方法扩增出线性化的完整抗体,并进行鉴定。结果从80个B细胞中获得了27株特异性重组单克隆抗体,并挑选出3株线性结合活性最强的抗体基因构建到表达载体上,共转染Expi293F^(TM)细胞后表达纯化,经过ELISA和Western blot验证,显示获得的抗体可以和EqIgG1-C蛋白有良好的结合作用。使用该方法可以省时高效的获得特异性抗体,为马的免疫学研究提供了重要研究工具,为鼠单克隆抗体筛选提供了技术拓展。

关键词：马IgG 单个B细胞PCR 抗体筛选技术单克隆抗体

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中国与美国RFLP 1-4-4 lineage1C变异株同一分支PRRSV的全基因组序列分析

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 202-207页

作者：许浒李超相丽润汤艳东赵静龚帮俊李宛生付军彭金美王倩周国辉冷超粮安同庆蔡雪辉张洪亮田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 南阳师范学院河南南阳473061

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变... 详细信息

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演化分析,结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株关系密切;其Nsp2推导氨基酸序列比对结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株在Nsp2区域存在相同的分子特征,即100个氨基酸(aa328~aa427)的连续缺失。PRRSV基因重组分析结果显示,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以类NADC34 IA14737-2016株为母本毒株,并由IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组基因片段的重组病毒,而中国早期的类NADC34 PRRSV是以IA/2014/NADC34株为母本毒株的重组病毒。美国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪的致病力差异较大,而中国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪多为中、低致病力。此外,中国HLJZD22-1812株与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5限制性片段长度多态性(RFLP)模式,且均属于lineage1C分支。本研究结果首次表明美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国类NADC34(PRRSV)属于同一亚型分支,且具有一致的分子特征,提示类NADC34 PRRSV在我国的流行及演化情况需高度关注。

关键词： 1-4-4 PRRSV变异株类NADC34 PRRSV 100个氨基酸缺失重组病毒

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猪链球菌LPxTG蛋白HP0197与外源蛋白的融合表达及融合蛋白抗原活性的检测

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中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 532-537页

作者：朱金鲁卫东高广娟陈平刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了从蛋白水平探究猪链球菌(S. suis)的表面LPxTG(Leu-Pro-x-Thr-Gly,x表示任何氨基酸)蛋白HP0197在S. suis表面展示外源抗原的可行性,本研究分别经PCR扩增HP0197蛋白的功能区编码基因片段hp0197(去除了HP1097全长蛋白aa1~aa40的转运... 详细信息

为了从蛋白水平探究猪链球菌(S. suis)的表面LPxTG(Leu-Pro-x-Thr-Gly,x表示任何氨基酸)蛋白HP0197在S. suis表面展示外源抗原的可行性,本研究分别经PCR扩增HP0197蛋白的功能区编码基因片段hp0197(去除了HP1097全长蛋白aa1~aa40的转运信号肽序列和aa524~aa56的CWA基序)、hp0197-18 ku基因片段(即HP0197蛋白的18 ku结构域的编码基因)、hp0197-Loop基因片段(HP0197蛋白aa201~aa523的编码基因片段),并通过融合PCR将gfp基因融合至上述两段基因即HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区编码基因之间,并构建表达HP-GFP融合蛋白的重组质粒及表达HP0197蛋白的重组质粒,经测序鉴定后将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导后采用SDS-PAGE鉴定。采用Ni-NTA亲和树脂方法纯化HP0197蛋白和HP-GFP融合蛋白后分别免疫小鼠,经间接ELISA检测首免后不同时间各组小鼠血清中的HP0197抗体和GFP抗体水平,评价HPGFP融合蛋白和HP0197蛋白的抗原活性。SDS-PAGE结果显示,分别经原核系统表达并纯化了HP-GFP融合蛋白和HP0197蛋白。间接ELISA结果显示,单独免疫HP0197蛋白的小鼠产生了HP0197抗体,但未产生GFP抗体;而免疫HP-GFP融合蛋白的小鼠,既产生了HP0197抗体,也产生了GFP抗体,且在首免后28 d这两种抗体效价均达1:204 800。上述结果表明在HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区之间插入外源蛋白,可在保留HP0197蛋白自身抗原活性的前提下,有效发挥外源蛋白的抗原活性。本研究首次在蛋白水平上证实了S. suis的LPxTG蛋白HP0197作为载体蛋白用于在S. suis表面展示外源蛋白的可行性,为进一步构建S. suis表面蛋白展示系统奠定了基础。

关键词：猪链球菌 LPxTG蛋白 HP0197 细菌表面展示载体蛋白

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