检索结果-内蒙古大学图书馆

结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

中国预防兽医学报 2023年第1期45卷 51-59页

作者：蔡珠明党光辉臧鑫鑫邵明珠唐阳阳鹿萍崔莹莹崔子寅刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(M... 详细信息

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

关键词：结核分枝杆菌复合群副结核分枝杆菌禽分枝杆菌禽亚种多重Taq Man荧光定量PCR

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SFTSV实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 292-297页

作者：于志亚杨鸣发马云云康洪涛姜骞刘家森李广兴曲连东东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。当质粒标准品浓度为4.22×10^(2)~4.22×10^(9)copies/μL时,荧光定量标准曲线C;值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.9998。该方法对发热伴血小板减少综合征病毒最低检测限为4.22×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍;该方法可特异性地检测出SFTSV,而对同科其他病毒检测结果均为阴性;批内、批间变异系数均小于2%。对采集的200只蜱进行检测,阳性检出率为3.5%,而常规RT-PCR方法的阳性检出率为2%。研究结果表明,本研究建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,为发热伴血小板减少综合征的检测提供了技术手段。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR

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基于转录组测序技术分析猪德尔塔冠状病毒诱导IPEC-J2细胞中自噬相关的变化

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中国兽医科学 2023年第3期53卷 320-331页

作者：江珊李秀丽李富强李程陈建飞张莉任卫科朱琪冯力鄢明华天津市农业科学院畜牧兽医研究所天津300381 国家动物疫病天津观测实验点天津300381 天津市畜禽健康养殖技术工程中心天津300381 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了探究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染宿主细胞后诱导细胞中发生的自噬相关变化,建立了PDCoV感染IPEC-J2细胞模型,通过间接免疫荧光和荧光定量PCR试验确定PDCoV在细胞中显著增殖。利用转录组测序获得了IPEC-J2细胞感染模型和正常细胞中... 详细信息

为了探究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染宿主细胞后诱导细胞中发生的自噬相关变化,建立了PDCoV感染IPEC-J2细胞模型,通过间接免疫荧光和荧光定量PCR试验确定PDCoV在细胞中显著增殖。利用转录组测序获得了IPEC-J2细胞感染模型和正常细胞中的全部表达基因15393个。通过基因覆盖度和测序饱和度分析明确数据符合分析要求后,进一步筛选了PDCoV感染导致表达量发生显著变化的基因(差异基因)2056个,其中自噬相关基因33个。采用荧光定量PCR方法检测12个自噬基因在细胞感染模型和正常细胞中的相对表达量,检测结果与高通量测序结果一致。通过GO功能和KEGG通路富集分析,明确差异基因主要富集的功能和信号通路,并重点展示了6条自噬相关信号通路。本研究初步展示了PDCoV在IPEC-J2细胞增殖过程中诱导细胞发生的自噬相关变化,为研究PDCoV通过诱导细胞自噬促进自身复制的分子机制提供了理论依据。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 IPEC-J2细胞转录组测序细胞自噬病毒复制

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不同马传染性贫血病毒株编码的S2蛋白拮抗SERINC5分子机理的研究

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 1-8页

作者：李荣荣李苏楠 Iqbal Ahmad 郑永辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒... 详细信息

为研究不同马传染性贫血病毒(EIAV)编码的S2蛋白拮抗宿主限制因子丝氨酸整合蛋白5(Ser5)的机制,本研究利用HIV-1野生型(WT)和HIV-1ΔNef前病毒质粒包装两种HIV-1假病毒,通过测定细胞上清中病毒粒子含量和靶细胞中荧光素酶活性检测病毒相对感染性,分析pSPEIAV19编码的S2蛋白(S2)和中国EIAV弱毒疫苗编码的S2蛋白(HRB-S2)对Ser5抗病毒活性的影响,结果显示S2和HRB-S2蛋白均能拮抗宿主Ser5的抗病毒活性,且S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染293T细胞,检测HRB-S2对Ser5表达的影响,结果显示HRB-S2能显著降解Ser5蛋白,并且HRB-S2降解Ser5的关键氨基酸位点是L^(26)。将表达Ser5和野生型HRB-S2及其突变体的质粒共转染Hela细胞,通过激光共聚焦试验检测HRB-S2对细胞内Ser5定位的影响,结果显示HRB-S2将位于细胞膜表面的Ser5表达下调并内化至细胞浆内,而L^(26)突变后HRB-S2下调Ser5的能力降低。将表达Ser5、HRB-S2、AP-2、Rab7和Rab11的质粒共转染293T细胞,检测AP-2、Rab7和Rab11在HRB-S2降解Ser5中的作用,结果发现三者在HRB-S2降解Ser5中均发挥重要的作用。将与VC或者VN融合表达的Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染Hela细胞,检测三者在细胞内的共定位情况,结果发现HRB-S2存在二聚体,而S2则不会形成二聚体。将表达Ser5、HRB-S2、S2的质粒共转染293T细胞,转染24 h后加入不同降解通路的抑制剂,检测S2降解Ser5的不同通路,结果显示HRB-S2可以通过蛋白酶体通路和溶酶体通路降解Ser5;而S2蛋白只通过溶酶体途径降解Ser5。本研究结果首次表明不同EIAV编码的S2蛋白均能通过降解Ser5蛋白而拮抗其抗病毒活性,其中S2拮抗Ser5的能力比HRB-S2强,HRB-S2蛋白的二聚体化可能会影响其对Ser5的敏感性。本研究阐明了不同EIAV S2蛋白拮抗Ser5的差异及机制,为抗逆转录病毒如HIV-1抗病毒制剂的开发提供参考依据。

关键词：丝氨酸整合因子5 逆转录病毒 S2 HRB-S2 抗病毒活性降解通路

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犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

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中国畜牧兽医 2022年第7期49卷 2462-2473页

作者：张媛于萌萌孙留克郭兴那雷刘荻萩姜骞张海丽王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室长春130062

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体:caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E基因具有2个不同剪接变体:caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒(H3N2_(GD11))和马流感病毒(H3N8_(JL89))RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒(H9N2_(ZJ12))RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3(P<0.05);而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。

关键词： A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32(caANP32) MDCK细胞聚合酶活性

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基于TaqMan探针非洲猪瘟病毒E301R基因荧光定量PCR检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2024年第9期37卷 1133-1139页

作者：葛海亮张柯慧于少雄曹宏伟李素杨玉莹仇华吉长江大学动物科学学院湖北荆州434023 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E301R基因荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,并进行验证,以期应用于临床样本中ASFV的检测。方法通过对ASFV E301R基因序列进行分析,选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针。PCR扩增E301R基因片段,克隆至pCAGGS载体,构建质粒标准品,建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性。采用建立的方法检测92份临床样本,并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较。另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析。结果质粒标准品在1.6×(10^(1)~108)拷贝/μL范围内,与Ct呈良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.239 x+40.774,R2=0.994;重复性及中间精密性验证CV均<2%;除ASFV外,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)均未出现扩增曲线;最低可稳定检出1.6×10^(1)拷贝/μL的质粒标准品;浓度为1.6×10^(2)和1.6×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90%~110%之间。建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7%(Kappa=0.932,P=1.000)。E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因。结论建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性,可用于临床样本中ASFV的检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 E301R基因 TaqMan探针荧光定量PCR法转录动力学

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鸭肠炎病毒疫苗株UL41和UL40基因间隔区作为其复制非必需区的鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 996-1000页

作者：刘静赵玉博焦晨晨陈普成胡玉珍姜永萍陈化兰柳金雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PC... 详细信息

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PCR和荧光显微镜观察对重组病毒进行鉴定,结果显示,经拯救得到表达RFP的重组病毒rDEV-ul4140RFP;所有代次的rDEV-ul4140RFP在显微镜下均能观察到红色荧光,表明重组病毒中的RFP基因稳定存在。将rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEFs)后,收集24 h、48 h、72 h、96 h的细胞和上清,检测TCID并绘制生长曲线。结果显示,rDEV-ul4140RFP在CEF中的生长曲线和亲本DEV疫苗株无显著差异。利用SPF鸭对rDEV-ul4140RFP的免疫保护效果进行评价。攻毒保护实验结果显示,rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株均能对SPF鸭提供100%的免疫保护。本研究结果证实DEV基因组UL41和UL40基因间隔区可作为外源基因的插入位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗提供参考依据。

关键词：鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9 复制非必需区

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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 1014-1019页

作者：薛梦迪黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队/黑龙江省兽医免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 详细信息

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。

关键词：病毒吸附模式识别受体病毒复制复制过程病原相关分子模式第一道防线病原微生物流感病毒

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自主研发生物安全型换笼工作台的性能检测与评价

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实验动物与比较医学 2022年第2期42卷 102-110页

作者：苏世博马文杰王伟郭慧娟张贺王梓康雷刘守琦刘怀然司昌德苟春天张伟陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型... 详细信息

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型换笼工作台(HT-1303)的各项性能指标进行检测,并判定其有效性及安全性。结果换笼工作台的主体外观完整性和稳定性、工作区洁净度、流入气流流速、下降气流流速、照度、噪声、气流流向、高效过滤器等检测效果良好,达到Ⅱ级生物安全柜标准。污染物品回收舱及器物表面灭菌舱的气密性效果良好,其尺寸、灭菌笼盒数量等还需进一步改进。结论本团队研制的生物安全型换笼工作台可实现整机正常运行,其各项指标合格,能够完成负压环境下独立通风笼具的更换,并保证操作者、实验对象及环境的安全。

关键词：换笼工作台性能检测生物安全

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部分兽医相关单位Ⅱ级生物安全柜的性能测试与分析

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实验动物与比较医学 2022年第2期42卷 111-116页

作者：马文杰张伟王伟苏世博郭慧娟张贺王梓刘怀然陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的了解兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜的性能与使用情况。方法测试哈尔滨市3家兽医相关单位正在使用的126台Ⅱ级生物安全柜,依据相关标准针对检测结果进行性能指标的判定与分析,了解生物安全柜的使用情况。结果126台Ⅱ级生物安全... 详细信息

目的了解兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜的性能与使用情况。方法测试哈尔滨市3家兽医相关单位正在使用的126台Ⅱ级生物安全柜,依据相关标准针对检测结果进行性能指标的判定与分析,了解生物安全柜的使用情况。结果126台Ⅱ级生物安全柜性能检测总合格率为17.5%。Ⅱ级生物安全柜的外观完整性、工作区洁净度、送排风高效过滤器检漏、气流模式、流入气流流速、下降气流流速、照度、噪声及报警和联锁系统共9个项目的检测总合格率分别为100%、100%、100%、100%、49.2%、92.9%、68.3%、22.2%和100%。结论兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜性能检测总合格率较低,应对生物安全柜做定期性能检测,加强运行维护管理,及时排除生物安全隐患,防止实验室感染事故发生。

关键词：生物安全柜性能检测兽医实验室

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