检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2020年第2期42卷 105-113页

作者：黄萌萌刘冉陈平朱金鲁卫东谢芳李刚刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白... 详细信息

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。

关键词：猪链球菌蛋白表面展示 LPxTG 信号肽胞壁锚定基序

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肠出血性大肠杆菌O157多重PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第4期42卷 360-365页

作者：张昕杨李火明夏颖李干武蔡文通中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的多重PCR检测方法,本研究选取调控基因fusR与n5512,联合经典的rfbE、stx1和stx2基因,共同作为靶基因,通过对引物浓度等参数优化,建立了稳定性好的检测EHEC O157的多重PCR方法。并检测了该方法的特... 详细信息

为了建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的多重PCR检测方法,本研究选取调控基因fusR与n5512,联合经典的rfbE、stx1和stx2基因,共同作为靶基因,通过对引物浓度等参数优化,建立了稳定性好的检测EHEC O157的多重PCR方法。并检测了该方法的特异性与敏感性,结果显示,该方法对非O157的产志贺毒素的大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、沙门氏菌、假结核耶尔森菌等检测均为阴性,特异性强;对EHEC基因组DNA的检测下限约为2.27×10-2ng/μL,对EHEC CFU的检测下限约为104cfu/mL。对人工感染菌的样品进行检测,增菌前与增菌后的检测限分别为:饲料,4×103cfu/g和4×10-4cfu/g;土壤,4×103cfu/g和4×10-2cfu/g;牛肉,8×10-1cfu/g和8×10-3cfu/g;废水,4×103cfu/g和4×10-3cfu/g。该方法还能检出感染了EHEC O157小鼠的粪便。综上,本研究建立了一种优化的EHEC O157多重PCR检测方法,为动物养殖与肉品加工过程中EHEC O157的检测提供了便捷、灵敏、可靠的技术手段。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157 多重PCR 检测

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弓形虫RH株感染比格犬动物模型的建立

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实验动物科学 2022年第3期39卷 6-10,32页

作者：问婉欣陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室国家禽类实验动物资源库哈尔滨150069

目的建立实验用犬人工感染人源强毒力型弓形虫的发病模型。方法将3只76日龄人工哺乳、正压隔离器内生长的实验用比格犬腹腔注射1.5×10^(7)个RH株速殖子,每日2次检测直肠体温、采集口腔拭子、直肠拭子,感染8 d后(8 dpi)安乐死所有... 详细信息

目的建立实验用犬人工感染人源强毒力型弓形虫的发病模型。方法将3只76日龄人工哺乳、正压隔离器内生长的实验用比格犬腹腔注射1.5×10^(7)个RH株速殖子,每日2次检测直肠体温、采集口腔拭子、直肠拭子,感染8 d后(8 dpi)安乐死所有动物。利用PCR检测拭子和血液中的弓形虫B1基因,利用荧光定量法检测8 dpi犬主要组织脏器中弓形虫529 bp重复片段的拷贝数,并对主要脏器进行组织病理学检测。结果结果表明3只实验犬在4~5 dpi均出现了一过性体温升高,轻微腹泻;2~6 dpi的咽拭子或肛拭子中能检测到弓形虫B1基因的核酸,且肛拭子阳性率高于咽拭子;8 dpi剖检后,均产生较多腹水;肝组织均出现明显的炎性变化;盲肠和肝中的弓形虫529 bp片段的核酸拷贝数最高。结论利用SPF级比格犬腹腔接种弓形虫RH株,主要引起一过性体温升高和短时腹泻,可导致肝组织变性和坏死,发病模型较温和。

关键词：刚地弓形虫比格犬发病模型

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新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 794-800页

作者：吴寒光孙军峰梁雨萌刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队哈尔滨150069

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检... 详细信息

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。

关键词：新城疫病毒复制溶瘤病毒细胞周期细胞凋亡

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HN蛋白糖基化位点缺失的新城疫病毒的生物学特性研究

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中国兽医杂志 2020年第6期56卷 1-4页

作者：艾惠孙军峰陈琳娜李乐韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

从黑龙江某鸡场中分离到1株新城疫病毒(NDV),命名为ck/CH/LHLJ170302株。全基因组序列测定和遗传进化分析表明,ck/CH/LHLJ170302株属于NDV class II类中的基因II型,与LaSota疫苗株的亲缘关系较近。分析基因分子特征发现,与LaSota株相比,... 详细信息

从黑龙江某鸡场中分离到1株新城疫病毒(NDV),命名为ck/CH/LHLJ170302株。全基因组序列测定和遗传进化分析表明,ck/CH/LHLJ170302株属于NDV class II类中的基因II型,与LaSota疫苗株的亲缘关系较近。分析基因分子特征发现,与LaSota株相比,ck/CH/LHLJ170302株编码的HN蛋白缺失了433位的糖基化修饰位点,而其他基因之间没有明显差异。进一步比较分析了ck/CH/LHLJ170302株与LaSota株在生长特性、致病性、抗原相关性方面的差异。结果发现,接种SPF鸡胚后,ck/CH/LHLJ170302株在24 h、48 h和72 h的病毒滴度均显著高于LaSota疫苗株(P<0.05),表明ck/CH/LHLJ170302株的增殖速度要快于LaSota株。毒力指标测定结果显示,ck/CH/LHLJ170302株引起鸡胚死亡平均时间(MDT)较LaSota株提前了近20 h,1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)略低于LaSota株。此外,ck/CH/LHLJ170302株与LaSota株的抗原相关性分析结果表明,ck/CH/LHLJ170302与LaSota株没有明显的抗原性差异。本研究结果为我国NDV的遗传变异的研究提供了参考数据。

关键词：新城疫病毒 HN蛋白糖基化位点生物学特性

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绵羊副流感病毒3型PE2019株的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2020年第5期42卷 434-438页

作者：朱远茂陈瑞红林俊杨木娇薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了确定引起绵羊呼吸道传染病的病原,本研究于2019年对一患急性呼吸道疾病死亡绵羊的病料进行了病毒分离,从其胸腔积液中分离到一株绵羊副流感病毒3型(OPIV3),命名为PE2019株。该病毒能够在MDBK细胞上增殖,产生细胞圆缩、集聚成簇等为... 详细信息

为了确定引起绵羊呼吸道传染病的病原,本研究于2019年对一患急性呼吸道疾病死亡绵羊的病料进行了病毒分离,从其胸腔积液中分离到一株绵羊副流感病毒3型(OPIV3),命名为PE2019株。该病毒能够在MDBK细胞上增殖,产生细胞圆缩、集聚成簇等为特征的细胞病变;电子显微镜观察可见OPIV3 PE2019株为直径约300 nm的圆形粒子;经检测该分离株病毒滴度为107.8TCID50/mL。分离株对小鼠和豚鼠的红细胞血凝价均为164,不凝集鸡、兔、绵羊和牛的红细胞。参考山羊副流感病毒3型全基因组序列(MK091103),设计其N和M基因特异性引物,通过RT-PCR可从病毒细胞培养物中扩增到特异性片段,对其进行序列分析,结果显示,分离株N基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为84.0%、82.1%和78.8%,M基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为81.5%、78.4%和77.6%,OPIV3 N和M基因均为独立一个分支。本研究首次于国内分离到OPIV3,为了解国内OPIV3的流行情况及疫苗的研制奠定了基础。

关键词：绵羊副流感病毒3型分离鉴定

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抗犬细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2020年第10期52卷 54-58页

作者：杨凯越宋彩玲李彤彤王文静陈慧宇赵爽爽刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为制备针对犬细小病毒(CPV)的单克隆抗体,以纯化的CPV免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用超速离心纯化的病毒作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤... 详细信息

为制备针对犬细小病毒(CPV)的单克隆抗体,以纯化的CPV免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用超速离心纯化的病毒作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、3G9和4F6。单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶64、1∶64、1∶128,腹水效价为1∶10^4、1∶10^4、1∶10^5。3株杂交瘤细胞的染色体数分别为92、94、98。亚类鉴定结果显示1D9和3G9重链为IgG1,4F6重链为IgG2b,轻链均为kappa链。病毒中和试验表明,单克隆抗体4F6对CPV具有明显的病毒中和活性。交叉试验表明,3株单克隆抗体均可与CPV特异性结合,与其他犬类常见病毒无交叉反应。本研究制备的单克隆抗体为CPV的检测及其感染动物的治疗提供了物质基础。

关键词：犬细小病毒单克隆抗体中和活性

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人源H7N9流感病毒促进Ⅰ型干扰素产生机制的研究

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中国预防兽医学报 2020年第1期42卷 1-5页

作者：李继清万晓朋于晓菲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为阐明不同来源H7N9流感病毒诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)产生水平差异及其机制,本研究选取人源流感病毒A/Anhui/1/2013(AH/1)株和禽源流感病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(PG/S1421)株作为模式病毒株,利用C57BL/6小鼠进行致病性试验。结... 详细信息

为阐明不同来源H7N9流感病毒诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)产生水平差异及其机制,本研究选取人源流感病毒A/Anhui/1/2013(AH/1)株和禽源流感病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(PG/S1421)株作为模式病毒株,利用C57BL/6小鼠进行致病性试验。结果显示,AH/1株感染可以致小鼠发病死亡,而PG/S1421株则不会致小鼠发病。采用间接免疫荧光试验和流式细胞试验分别对两株病毒在A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的感染效率进行检测,结果显示两株病毒在两种细胞中的感染效率无显著差异。将该两株病毒分别感染小鼠腹腔巨噬细胞,在感染后不同时间点收集培养上清,并裂解细胞收取细胞总蛋白。采用ELISA方法对细胞培养上清IFN-Ⅰ含量进行测定。结果显示,感染后不同时间,AH/1株和PG/S1421株均可以诱导IFN-Ⅰ产生,但相较于PG/S1421株,AH/1株感染可以诱导细胞产生更多的IFN-Ⅰ;利用western blot对细胞总蛋白中IFN-Ⅰ产生信号通路的上游感受器分子视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)的表达水平进行检测。结果显示,在PG/S1421株感染细胞的12 h内,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量无显著变化,而AH/1株感染后,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量增加,并且表达量随时间延长而上升。以上试验结果表明,AH/1株感染可以通过上调RIG-Ⅰ表达进而诱导宿主细胞产生更多IFN-Ⅰ。本研究阐明了人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的初步机制,为进一步解析人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的精细分子机制以及免疫逃逸机制奠定了基础,为H7N9流感防控提供参考依据。

关键词： H7N9流感病毒 Ⅰ型干扰素 RIG-Ⅰ

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用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建

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中国预防兽医学报 2020年第12期42卷 1292-1295页

作者：张纪文王露露李芳刘杏赵东明步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了进行CRISPR文库筛选,本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T)获取高滴度的重组慢病毒,收集重组慢病毒并感染... 详细信息

为了进行CRISPR文库筛选,本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T)获取高滴度的重组慢病毒,收集重组慢病毒并感染N2a细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。Western blot结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白;利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力;利用CellTiter-Glo试剂检测结果显示,Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。

关键词：基因编辑慢病毒高通量筛选鼠神经瘤母细胞

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B亚型禽偏肺病毒灭活疫苗对商品肉鸡免疫效果的研究

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1071-1075页

作者：包媛玲何锡栋于蒙蒙刘鹏陶蓉蓉肖美丽王素艳李欣翼胡守平刘爱晶张艳萍刘长军祁小乐王笑梅高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽免疫抑制病创新团队黑龙江哈尔滨150069 福建圣泽生物科技发展有限公司福建南平354100 扬州大学江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

为了研究B亚型禽偏肺病毒(a MPV/B)灭活疫苗对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究选取21日龄的商品肉鸡,将前期研制的a MPV/B灭活疫苗通过肌肉注射的方式免疫商品肉鸡(0.5 mL/只),以注射相同剂量PBS的商品肉鸡作为阴性对照组。于首免后3周... 详细信息

为了研究B亚型禽偏肺病毒(a MPV/B)灭活疫苗对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究选取21日龄的商品肉鸡,将前期研制的a MPV/B灭活疫苗通过肌肉注射的方式免疫商品肉鸡(0.5 mL/只),以注射相同剂量PBS的商品肉鸡作为阴性对照组。于首免后3周加强免疫1次,分别采用ELISA和中和试验检测首免1周~6周后各组鸡血清中的IgG抗体效价和中和抗体效价。结果显示,首免后3周及加强免疫后3周(首免后6周),各组鸡血清平均IgG抗体效价分别为1:11864和1:36619,平均中和抗体效价分别为4.7 log2和6.5 log2。而阴性对照组鸡血清均无IgG抗体和中和抗体产生。加强免疫后3周以a MPV/B LN16株(5000 TCID_(50)/只)攻毒,观察攻毒后1 d~7 d各组鸡的临床症状,统计免疫保护率。结果显示,免疫组有一只鸡挤压有鼻液,其他鸡均无明显症状,发病率为10.0%,而对照组鸡出现混浊或粘稠泡沫样、牵丝状鼻液,鼻痂等症状,且发病率达90.0%,经计算,疫苗免疫保护率达88.9%;通过RT-qPCR检测首免后1 d~6 d采集的各组鸡鼻腔拭子中的病毒基因拷贝数,分析其排毒情况。结果显示,攻毒后1 d~6 d,免疫组鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数较对照组鸡下降64.6%~80.7%;攻毒后9 d剖杀各组鸡,采集各组鸡鼻甲、气管及肺组织,制作病理切片后观察各组织病理学变化。结果显示,对照组鸡的鼻甲黏膜、气管黏膜及肺房壁均可见炎性细胞浸润,而免疫组鸡上述各组织均未见明显病理变化。本研究首次表明,aMPV/B灭活疫苗能够诱导商品肉鸡产生较高水平的体液免疫反应,并且对鸡产生较好的免疫保护效果。本研究对控制a MPV/B的传播与流行具有重要意义。

关键词： B亚型禽偏肺病毒灭活疫苗商品肉鸡免疫保护

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