检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： Cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

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基于Gluc的马源NLRP3炎症小体激活系统的建立

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中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1039-1044页

作者：王岩刘聪那雷王雪峰林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速、敏感的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统,本研究利用PCR扩增马IL-1β(eqIL-1β)、马Caspase-1(eqCaspase-1)、马ASC(eqASC)和马NLRP3(eqNLRP3),构建重组真核表达质粒pCAGGS-eqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA,分别转染HEK 293T细胞,培养24 h后采用western blot方法检测细胞中各蛋白的表达,结果显示各重组质粒均构建正确,且均在HEK 293T细胞中正确表达;通过质粒共转染HEK 293T细胞依次对NLRP3炎症小体复合物中不同组分进行剂量依赖性试验,培养24 h后采用western blot检测细胞中切割的eqIL-1β蛋白,利用荧光素酶底物检测细胞上清中的荧光强度,结果显示NLRP3炎症小体体外激活系统中各质粒的最适转染剂量分别为pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCaspase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng;通过在该系统中加入不同剂量的NLRP3炎症小体激活剂(Nigericin),检测该系统有效性,结果显示细胞中切割的IL-1β蛋白水平以及上清中的荧光强度与Nigericin存在剂量依赖性,表明基于Gluc的马源NLRP3炎症小体体外激活系统正确构建,且其能对马源NLRP3炎症小体激活的相关蛋白和药物进行筛选。本研究建立的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统为马属动物炎症及炎症小体调控方面的研究提供重要的工具。

关键词： NLRP3炎症小体 IL-1β Gluc

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马M2型CD163单克隆抗体的制备及其在巨噬细胞极化类型检测中的应用

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1159-1166页

作者：段盈伊王欣慧陈克伟刘荻萩戚亭郭奎杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬... 详细信息

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬细胞经不同病原感染后的极化表型,本实验截取马巨噬细胞极化标志物CD163基因的SRCR1~SRCR4区域,并分别经原核和真核表达系统表达该重组蛋白CD163。将原核表达的马CD163蛋白免疫小鼠制备CD163的单克隆抗体(MAb),经western blot和激光共聚焦检测该MAb的反应性。以上述实验为基础,采用荧光定量PCR检测不同病原感染巨噬细胞后的3种极化标志物和3种细胞因子基因的转录水平以确定感染后的巨噬细胞的极化表型;将不同病原感染马巨噬细胞24 h后,利用制备的CD163 MAb分别采用流式细胞术检测表达CD163蛋白的马巨噬细胞数量,以及采用western blot检测不同病原感染巨噬细胞后的CD163蛋白的表达量,以进一步鉴定马巨噬细胞的极化状态。荧光定量PCR结果表明,经LPS+IFN-γ诱导后,马巨噬细胞向M1型发生了极化,TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80基因可以作为鉴定M1型马巨噬细胞的标记基因;而经IL-4或者IL-10诱导后,马巨噬细胞向M2型发生了极化,TGF-β、IL-10、CD206、CD163基因可以作为鉴定M2型马巨噬细胞的标记基因。MAb western blot和激光共聚焦结果显示,该MAb与真核表达的CD163蛋白以及经IL-10诱导后马巨噬细胞表达的内源性CD163蛋白均能够很好反应,可以用于马巨噬细胞极化状态的检测。荧光定量PCR结果显示,马流产沙门氏菌(*** equi)、马疱疹病毒(EHV-1)和马动脉炎病毒(EAV)感染马巨噬细胞24 h后,M1型细胞因子TNF-α、IL-1β和其表面标记物CD80基因mRNA的转录水平均显著上调(p<0.05),而EIAV感染24 h后,M2型细胞因子IL-10和其表面标记物CD206、CD163基因的mRNA的转录水平均不同程度的上调。表明*** equi、EHV-1和EAV均能诱导马巨噬细胞极化为M1型,并释放大量促炎性因子,而EIAV则可以诱导巨噬细胞极化为M2型,产生了抑炎因子。利用制备的CD163 MAb经流式细胞术和westen blot鉴定结果均表明,在各病原感染早期,EIAV感染可以诱导马巨噬细胞极化为M2型,而其余3种病原未能诱导马巨噬细胞发生M2型的极化。本研究制备了CD163 MAb并利用其检测了不同病原感染后马巨噬细胞极化的表型,丰富了相关疾病发生机制研究的生物学工具。

关键词：马 M2型巨噬细胞 CD163蛋白单克隆抗体

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适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

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中国兽医科学 2020年第2期50卷 183-188页

作者：佟相慧问婉欣陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结... 详细信息

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。

关键词：鸭瘟病毒鸭胚肝间充质干细胞主要组织相容性复合体单倍型

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B型流感病毒NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 779-785页

作者：徐菱张振宇郭兴于萌萌王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏... 详细信息

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 3C3-7经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IBV NP蛋白的双MAb夹心ELISA检测方法。结果显示,该检测方法捕获抗体包被量为每孔100 ng,检测抗体使用量为每孔20 ng,NP蛋白浓度在3.9 ng/mL^62.5 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。利用该ELISA方法对多种病毒进行检测,结果显示该方法仅能与IBV发生反应,表明该方法特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对病毒NP蛋白的最低检测限为13.26 ng/mL,敏感性高;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好;捕获抗体可在25℃和37℃保存4 d,热稳定性好。利用本实验建立的ELISA方法和qPCR方法对本实验室保存的40份人咽拭子进行检测,该方法与qPCR方法相比符合率为70%,表明本研究建立的方法可用于临床检测。本研究建立的ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为B型流感的快速诊断、NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

关键词： B型流感病毒 NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA

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靶向M细胞的抗原递送——增强黏膜免疫应答的关键策略

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生物工程学报 2019年第2期35卷 216-225页

作者：王翌李淼孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

黏膜是阻止病原入侵的第一道防线,黏膜免疫系统在抵抗感染方面起着至关重要的作用。通过黏膜途径接种疫苗可以同时诱导黏膜和全身免疫反应,因此,理论上针对黏膜的免疫策略是最合理和有效的。但黏膜免疫系统的复杂性和屏障作用造成抗原... 详细信息

黏膜是阻止病原入侵的第一道防线,黏膜免疫系统在抵抗感染方面起着至关重要的作用。通过黏膜途径接种疫苗可以同时诱导黏膜和全身免疫反应,因此,理论上针对黏膜的免疫策略是最合理和有效的。但黏膜免疫系统的复杂性和屏障作用造成抗原诱导的免疫应答水平低下,制约了黏膜疫苗的发展。M细胞(Microfoldcells)是黏膜免疫系统所独有的,其具有捕获腔内抗原和启动抗原特异性免疫应答的功能。M细胞摄取抗原的多少直接关系到黏膜疫苗的免疫效力,而利用M细胞配体可将抗原靶向递呈给M细胞,从而实现高效的黏膜免疫应答。靶向M细胞的抗原递送策略及其应用可以提高黏膜免疫应答水平,促进黏膜疫苗的研制。尽管如此,要成功研制安全高效的黏膜疫苗,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于进一步探究M细胞的特性和功能及黏膜免疫机制。

关键词：靶向性抗原递送 M细胞黏膜免疫黏膜疫苗

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鸭外周血白细胞的单细胞转录图谱研究

鸭外周血白细胞的单细胞转录图谱研究

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：梁雨萌马勇张艳慧陈志杰王志涛李雪峰崔露胥利刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队

鸭是一种重要的经济水禽,也是一些人畜共患病病原(如流感病毒和黄病毒)的天然宿主。然而,目前对鸭的免疫系统及其与病毒的相互作用仍缺乏深入的了解。外周血白细胞是鸭免疫系统抵抗虫媒传染病病原的第一道防线。本研究利用高通量单细胞m... 详细信息

鸭是一种重要的经济水禽,也是一些人畜共患病病原(如流感病毒和黄病毒)的天然宿主。然而,目前对鸭的免疫系统及其与病毒的相互作用仍缺乏深入的了解。外周血白细胞是鸭免疫系统抵抗虫媒传染病病原的第一道防线。本研究利用高通量单细胞mRNA测序(scRNA-seq)在单细胞水平构建了鸭外周血白细胞的转录图谱,将鸭外周血白细胞分为16个亚群,并确定了各亚群的分子标记。此外,与人外周血白细胞单细胞转录图谱的比较分析发现,髓系细胞在外周血白细胞中的聚类存在物种间差异。

关键词：鸭单细胞转录组测序外周血白细胞

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小反刍兽疫病毒芯片式数字PCR检测方法的建立及应用

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中国动物检疫 2021年第12期38卷 91-98页

作者：杨鸣发马云云于志亚刘家森康洪涛姜骞曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人畜共患病团队黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)检测方法,建立了一种芯片式数字PCR(cdPCR)检测方法。根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75/1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 b... 详细信息

为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)检测方法,建立了一种芯片式数字PCR(cdPCR)检测方法。根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75/1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 bp片段,构建pMD^(TM)18-N标准质粒并优化反应条件,建立了PPRV N基因cdPCR检测方法,并与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果显示:当质粒标准品浓度在1.22×(10^(5)~10^(2))copies/μL范围时,cdPCR检测方法比普通RT-PCR灵敏度高1000倍,且稳定性好,特异性强;当标准品浓度在1.22×(10^(5)~10^(-3))copies/μL范围时,cdPCR与RT-qPCR相比具有相同的特异性,但灵敏性比RT-qPCR高100倍;与RT-qPCR测定结果(13.29±6.74)copies/μL相比,cdPCR的最低检测限更低,约为(0.44±0.14)copies/μL;cdPCR对47份临床样本的PPRV核酸阳性检出率(25.5%)高于RT-qPCR(17.0%)。结果表明,建立的cdPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为预防PPR早期流行提供了一种快速有效的诊断和定量检测方法。

关键词：小反刍兽疫病毒(PPRV) 芯片式数字PCR(cdPCR) 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

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人工感染禽腺病毒血清4型对鹅天然免疫反应的影响

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中国兽医科学 2020年第2期50卷 222-232页

作者：李雪峰姜磊孙金艳李慧昕马得莹东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省农业科学院畜牧研究所黑龙江哈尔滨150086

将50只30日龄的健康鹅随机分为攻毒组、观察组和对照组,观察并采集样品,检测抗体水平、病毒血症、病毒载量,应用real-time PCR(RT-PCR)方法检测肝、心脏组织中β-防御素(Av BDs)、Toll样受体(TLRs)、细胞因子(cytokines)等基因表达量。... 详细信息

将50只30日龄的健康鹅随机分为攻毒组、观察组和对照组,观察并采集样品,检测抗体水平、病毒血症、病毒载量,应用real-time PCR(RT-PCR)方法检测肝、心脏组织中β-防御素(Av BDs)、Toll样受体(TLRs)、细胞因子(cytokines)等基因表达量。初探人工感染鸡源禽腺病毒血清4型(FAdV-4)对鹅的致病性及机体对该病毒形成的天然免疫反应机制。结果显示,感染该FAdV-4毒株后,鹅均没有明显病症和死亡发生。宿主产生特异性抗体,并且肝、心脏组织出现病理学变化,宿主排毒率和病毒载量呈上升趋势。感染早期(36 h和72 h),Av BD1、2、5、9、16,TLR2、3、7、15,IL-1β、2、6、8、18以及髓样分化因子(My D88)在肝中的基因表达量显著上调(P<0.05)或有上调趋势。证实,鸡源FAdV-4对鹅的致病性较弱,可能与实验动物品种、日龄差异或感染途径等条件有关。宿主可通过TLRs-My D88途径引起机体产生大量的免疫因子,参与机体抗病毒免疫反应。本试验结果为深入研究FAdV-4与宿主早期天然免疫间的相互作用提供了新的参考。

关键词：禽腺病毒血清4型禽β-防御素 Toll样受体细胞因子天然免疫反应

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杆菌七肽抗菌谱和溶血性的研究

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中国畜牧杂志 2020年第4期56卷 159-164页

作者：张江李火明蔡文通周晓容安杰利(重庆)生物科技有限公司重庆402460 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 重庆市畜牧科学院重庆402460

本试验旨在研究杆菌七肽抗菌谱和体外对人工肠液和胃液的稳定性、溶血性,为其在饲料中替代抗生素提供理论依据。试验采用管碟法测定抑菌圈来研究杆菌七肽对18株微生物的抑制作用,并研究高温水浴、人工肠液、人工胃液处理后的抑菌活性以... 详细信息

本试验旨在研究杆菌七肽抗菌谱和体外对人工肠液和胃液的稳定性、溶血性,为其在饲料中替代抗生素提供理论依据。试验采用管碟法测定抑菌圈来研究杆菌七肽对18株微生物的抑制作用,并研究高温水浴、人工肠液、人工胃液处理后的抑菌活性以及不同浓度杆菌七肽对红细胞的溶血率。结果表明:杆菌七肽对大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、布氏杆菌(Brucella melitensis)、嗜水气假单胞菌(Pseudomonas hydrophila)等具有明显的抑制作用,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)没有抑制作用,且抑菌活性不受热处理、人工胃液和肠液的影响;不同浓度的(12.5~100μg/mL)杆菌七肽处理红细胞的溶血率都低于5%。结果显示,杆菌七肽抗菌谱主要为革兰氏阴性菌;杆菌七肽对热处理、人工胃液和人工肠液具有很好的耐受性,而且对受试红细胞溶血性低。

关键词：杆菌七肽抗菌谱饲用抗生素溶血性

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