检索结果-内蒙古大学图书馆

病毒学报 2011年第4期27卷 353-357页

作者：孙美玉秦立廷高玉龙祁小乐高宏雷王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞... 详细信息

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。

关键词：禽呼肠孤病毒 σC基因 sf9细胞杆状病毒

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

引用

中国兽医科学 2011年第2期41卷 152-158页

作者：危艳武刘长明范培虎吴洪丽温士刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/... 详细信息

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株细胞传代毒力试验

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猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P株的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 681-684页

作者：时洪艳陈建飞王承宝张志榜石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观... 详细信息

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV)。致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23]。

关键词：猪轮状病毒分离鉴定

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猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

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中国兽医科学 2011年第1期41卷 31-35页

作者：张志榜陈建飞时洪艳陈小金冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达载体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达。结果显示,重组菌... 详细信息

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达载体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达。结果显示,重组菌pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)的分子质量约为95ku,在IPTG浓度为0.8mmol/L、诱导时间为6h时,重组菌的表达效果最好,重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。Western-blot结果显示,rM能与兔抗PEDV多克隆抗血清及PEDV M蛋白单克隆抗体发生特异的免疫印迹反应,表明原核表达的rM蛋白具有良好的反应原性,这为进一步开展PEDV M蛋白的研究奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 M蛋白原核表达免疫印迹

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抗猪输血传播病毒1型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第12期33卷 974-978页

作者：张龙刘建波黄立平郭龙军危艳武唐青海吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为制备抗猪输血传播病毒1型(TTV1)Cap蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用PCR法扩增TTV1ORF1(1501 nt～2475 nt)编码重组Cap蛋白的C末端截短序列,将PCR产物克隆于pGEX-6P-1载体中,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达,获得含GST标签... 详细信息

为制备抗猪输血传播病毒1型(TTV1)Cap蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用PCR法扩增TTV1ORF1(1501 nt～2475 nt)编码重组Cap蛋白的C末端截短序列,将PCR产物克隆于pGEX-6P-1载体中,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达,获得含GST标签的重组蛋白(rCap),经SDS-PAGE和western blot鉴定表明rCap约为64.0 ku,以包涵体形式存在。用纯化的rCap免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗rCap蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚类均为IgG1/κ型;western blot鉴定表明有7株MAbs与rCap产生特异性反应,另1株MAb呈阴性。为验证8株MAbs与真核表达的Cap蛋白的免疫反应性,将全长与截短的TTV1 ORF1基因片段克隆于pcDNA3.1载体,转染293T细胞进行蛋白瞬时表达,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法检测表明,这8株MAbs均能够与瞬时表达的全长rCap产生特异性反应,其中6株与截短表达的rCap反应。本研究表达的rCap蛋白及制备的MAbs,为该病毒检测方法的建立及抗原表位的鉴定奠定了基础。

关键词：猪输血传播病毒1型重组Cap蛋白单克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 833-836页

作者：石达陈建飞时洪艳张志榜冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征。本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因... 详细信息

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征。本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib。将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞。Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染VeroE6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位。该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白纤维蛋白共定位

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检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用

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中国预防兽医学报 2011年第1期33卷 70-72页

作者：刘芹防刘杉杉张超范崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原,建立了检测PTV抗体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法。该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1∶10;FITC标记二抗最适稀释度为1∶100;二抗中伊文氏兰最适稀释度... 详细信息

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原,建立了检测PTV抗体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法。该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1∶10;FITC标记二抗最适稀释度为1∶100;二抗中伊文氏兰最适稀释度为1∶30 000。敏感性试验、特异性试验表明该抗原板可以检出包含PTV-8型和1型在内的的所有PTV阳性血清,方法敏感、特异。与SN符合率94.0%。用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1 500份临床血清样品进行检测,阳性检出率为55.8%,表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍。该方法做为PTV的血清学诊断新技术,为开展PTV分子流行病学调查奠定了基础。

关键词：猪捷申病毒间接免疫荧光抗体检测

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猪JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2 TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 873-876页

作者：蔺文成王晓玲刘芹防崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立定量检测猪Janus激酶(JAK)和信号转导和转录激活因子(STAT)mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪JAK-1,JAK-2,STAT-1、STAT-2及管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性重组质粒,建立了Taq... 详细信息

为建立定量检测猪Janus激酶(JAK)和信号转导和转录激活因子(STAT)mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪JAK-1,JAK-2,STAT-1、STAT-2及管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性重组质粒,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明:所建立的检测方法荧光定量PCR扩增均无非特异性产物的产生;检测下限均达1.0×101 copies/μL;批内及批间变异系数均小于2%。利用该方法对猪细小病毒(PPV)感染ST细胞48 h后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2 mRNA的转录水平进行了检测,结果表明:JAK-1和JAK-2转录水平显著上调,STAT-1和STAT-2转录水平呈现下调趋势,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适于猪细胞传导因子JAK和STAT的定量检测。

关键词： I型干扰素 JAK-STAT 荧光定量PCR 检测

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稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

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中国预防兽医学报 2011年第5期33卷 358-361页

作者：黄俊华贺番孙元张鑫常天明李宏宇仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以***21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培... 详细信息

为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以***21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性。本研究建立稳定表达T7RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法。

关键词：逆转录病毒载体 T7RNA聚合酶稳定细胞系

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三株鸡马立克氏病病毒流行毒株基因组重复区的序列测定及分析

引用

中国兽医科学 2011年第7期41卷 666-671页

作者：许娜娜刘长军张艳萍李志杰侯广玉张锋丛锋杨文闯成云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

对国内3株马立克氏病病毒血清1型(Marek’s disease virus type 1,MDV-1)流行毒株的基因组重复区进行序列测定及分析,并与GenBank中登录的MDV-1参考毒株序列进行比较。结果显示,3株毒株的基因组重复区序列具有较高同源性,在进化上属于... 详细信息

对国内3株马立克氏病病毒血清1型(Marek’s disease virus type 1,MDV-1)流行毒株的基因组重复区进行序列测定及分析,并与GenBank中登录的MDV-1参考毒株序列进行比较。结果显示,3株毒株的基因组重复区序列具有较高同源性,在进化上属于一独立分支。3株毒株的长重复区长度约为12kb,预测的开放阅读框(ORF)分别为43、40、43个;短重复区约为12kb,预测的ORF分别为27、25、26个。3株毒株的多个ORF中存在它们特有的共性氨基酸突变,是国内MDV-1流行毒株的特有的遗传性特征。该研究为我国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。

关键词：马立克氏病病毒基因组重复区序列分析致病性

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