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中国预防兽医学报 2019年第4期41卷 396-401页

作者：李鹤党光辉于申业程玉笛刘虹秀宋宁宁陈利苹刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队

探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结... 详细信息

探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结果显示,蛋白加菌蜕佐剂组可以刺激小鼠产生持久高水平的抗体,并且菌蜕佐剂的免疫增强效果高于弗氏不完全佐剂;IgG1/IgG2a的比率增高,提示蛋白加菌蜕佐剂组小鼠趋向于Th2型免疫反应,同时可以诱导淋巴细胞分化为CD4+T细胞亚群并产生IFN-γ及IL-4细胞因子;病理组织学显示以菌蜕佐剂配伍蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的安全性。本研究为结核病的预防和新型疫苗的研发奠定了一定的基础。

关键词：结核病菌蜕佐剂亚单位疫苗免疫应答

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猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 584-589页

作者：刘冉黄萌萌陈平朱金鲁谢芳刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(***)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自***2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果... 详细信息

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(***)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自***2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在***和***中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在***中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在***中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是***的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在***遗传操作中具有很好的应用前景。

关键词：猪链球菌强启动子筛选和鉴定翻译延伸因子EF-Tu 烯醇化酶

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耻垢分枝杆菌诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成的研究

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1154-1158页

作者：臧鑫鑫党光辉王忠星刘虹秀崔子寅崔莹莹宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光... 详细信息

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光的MS与中性粒细胞共孵育,通过激光共聚焦观察NETs的形成;采用Pi-coGreen~?dsDNA试剂盒定量分析胞外ds DNA的释放量;并且通过菌落计数统计MS的存活情况。结果显示,MS能够诱导中性粒细胞形成NETs,胞外游离DNA的释放量随着时间的延长而逐渐增多,与对照组相比差异极显著(p<0.01或p<0.001),且NETs能够杀灭MS。本研究为后续利用MS作为模式菌研究结核分枝杆菌重要蛋白功能的研究提供参考依据。

关键词：耻垢分枝杆菌中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网

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蛋鸡感染传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定

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中国家禽 2020年第5期42卷 36-40页

作者：王雨龙范林进姜楠高玉龙李凯高立刘长军崔红玉潘青张艳萍王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 世界动物卫生组织传染性法氏囊病参考实验室黑龙江哈尔滨150001 江苏高校动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)新型变异株正在成为养禽业健康发展新的重要威胁。目前报道的IBDV新型变异株均来自肉鸡群的感染。为了解IBDV新型变异株感染蛋鸡的情况,通过对黑龙江省一个疑似非典型IBD发病... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)新型变异株正在成为养禽业健康发展新的重要威胁。目前报道的IBDV新型变异株均来自肉鸡群的感染。为了解IBDV新型变异株感染蛋鸡的情况,通过对黑龙江省一个疑似非典型IBD发病蛋鸡群样品进行RT-PCR检测及相关分析,结果显示,引起该鸡群非典型IBD的病原是IBDV新型变异株。这是蛋鸡感染IBDV新型变异株的首次报道,对于更全面了解IBDV新型变异株的流行态势具有重要意义。

关键词：传染性法氏囊病病毒新型变异株蛋鸡

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2017年我国4个省份屠宰场猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国预防兽医学报 2019年第12期41卷 1210-1214页

作者：王长珍刘文宇祝瑶栾天于淼杨亲刘思国张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨市产品质量监督检验院黑龙江哈尔滨150036

为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方... 详细信息

为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方法检测分离菌的耐药基因和毒力基因;通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析不同来源分离株间的亲缘关系。结果显示,从4省市共分离到猪链球菌46株,包括12种血清型和3种荚膜新型血清型,其中猪链球菌血清7型分离率最高,为30.4%,但不同地区血清型交叉密度较低。分离菌株表现出广泛耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、多西环素的耐药率较高,分别为91.30%、86.96%、86.96%,但分离株均对万古霉素敏感。红霉素类耐药基因erm和四环素类耐药基因tet的检出率均较高,其中erm(B)为97.83%,tet(O)为89.13%。PFGE结果显示不同地区分离菌株PFGE谱型差异明显,而同一地区分离菌株PFGE谱型相似或相同,提示同一地区猪链球菌存在克隆传播现象。本研究揭示了我国不同地区猪链球菌流行情况,为猪链球菌病的防控提供参考依据。

关键词：猪链球菌流行病学耐药 PFGE

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肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2019年第4期41卷 356-360页

作者：王曼宇王忠星曹俊许秋刘思国于申业吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回... 详细信息

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。

关键词： MreB蛋白沙门菌生物学特性环境压力

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猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 462-467页

作者：陈平刘冉黄萌萌朱金鲁谢芳倪宏波刘思国张跃灵黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(***)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克... 详细信息

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(***)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 SSU05_0630 基因缺失同工酶

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天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

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中国兽医科学 2019年第11期49卷 1397-1405页

作者：董志民李秀丽田向学杨春蕾燕晓翠谭世旭张万江刘思国鄢明华天津市畜牧兽医研究所天津300381 农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站天津300381 天津市畜禽健康养殖技术工程中心天津300381 天津市宁河区芦台第一中学天津301500 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌... 详细信息

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CFU/mL,最大值为5.7×10^8 CFU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CFU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。

关键词：猪链球菌9型致病性黏附能力溶血性毒力基因

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牛副结核分枝杆菌的分离及鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1177-1180页

作者：刘虹秀程玉笛党光辉李田田李鹤崔子寅宋宁宁陈利苹刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为进一步确定新疆某奶牛场疑似感染副结核病的病原菌,本研究采集了37头疑似患病奶牛的直肠刮取物,应用卵黄琼脂培养基对其进行分枝杆菌的分离培养,经菌落形态观察、抗酸染色以及多重PCR等方法对分离菌进行病原学鉴定,并利用副结核分枝... 详细信息

为进一步确定新疆某奶牛场疑似感染副结核病的病原菌,本研究采集了37头疑似患病奶牛的直肠刮取物,应用卵黄琼脂培养基对其进行分枝杆菌的分离培养,经菌落形态观察、抗酸染色以及多重PCR等方法对分离菌进行病原学鉴定,并利用副结核分枝杆菌亚型鉴定引物进行PCR扩增及测序分析。结果显示,分离培养的7株分离菌均为抗酸染色阳性的分枝杆菌;经多重PCR鉴定,其中3株谱型与副结核分枝杆菌k10参考株一致;进一步通过基因分型的PCR扩增及测序分析,确定这3株分离菌均为牛副结核分枝杆菌。本研究为进一步开展该菌病原学和流行病学研究提供了必要的研究资料。

关键词：副结核分枝杆菌分离培养多重PCR 亚型鉴定

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牛副结核分枝杆菌多组分亚单位疫苗的初步研究

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中国预防兽医学报 2018年第10期40卷 940-944页

作者：程玉笛党光辉李鹤李哲刘虹秀宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为筛选出最佳的预防副结核病的候选疫苗,本研究评价了副结核分枝杆菌(MAP)培养上清、MAP细胞壁和MAP灭活菌体的免疫保护效果。将160只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组20只,分别为PBS组、菌影(Ghost)组、弗氏不完全佐剂(IFA)组、上... 详细信息

为筛选出最佳的预防副结核病的候选疫苗,本研究评价了副结核分枝杆菌(MAP)培养上清、MAP细胞壁和MAP灭活菌体的免疫保护效果。将160只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组20只,分别为PBS组、菌影(Ghost)组、弗氏不完全佐剂(IFA)组、上清+Ghost组、上清+IFA组、细胞壁+Ghost组、细胞壁+IFA组和灭活苗组,分别经皮下注射免疫后在不同的时间点采集小鼠尾静脉血,利用间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价。三免后以5×10~8cfu/只剂量进行腹腔攻毒。结果显示:细胞壁+IFA组小鼠的抗体水平明显高于其它组(p<0.001),细胞壁+Ghost组次之(p<0.001);除阴性对照组外,各组小鼠IgG1的滴度均高于IgG2a (p<0.001);细胞壁+IFA组和细胞壁+Ghost组的小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-4和IL-10的含量显著高于其它实验组(p<0.001);细胞壁+IFA组IL-2的含量明显高于其它实验组(p<0.001),细胞壁+Ghost组次之(p<0.01);细胞壁+IFA组小鼠的肝脏、脾脏和小肠组织的荷菌量显著少于其它实验组(p<0.01),细胞壁+Ghost组次之(p<0.05),表明MAP细胞壁可以刺激机体产生较高水平的抗体,机体的免疫反应倾向于体液免疫,且细胞壁对攻毒小鼠的保护效果最好。本研究为反刍动物副结核病疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：副结核分枝杆菌培养上清细胞壁灭活苗

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