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鸡贫血病毒vp1和vp2基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性的初步研究

中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 495-499页

作者：林欢高宏雷王晓艳高玉龙宋修庆李术强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国科学院生物物理研究所北京100101 哈尔滨工业大学海洋学院山东威海264209

利用特异性引物从pBluemCAV中PCR扩增得到鸡贫血病病毒(CAV)vp1、vp2基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至EcoRⅠ和NotⅠ双酶切处理的表达载体pPIC9K中,构建了真核表达质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2。将pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2转化至毕赤酵母SMD1168中,在0.5%甲醇诱导下表达CAV-VP1、CAV-VP2蛋白,运用Westernblot和Dot-ELISA鉴定表达蛋白。结果表明,重组酵母菌株表达出约54ku和24ku的目的蛋白,与针对鸡贫血病毒的单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物乳化后免疫6周龄BALB/c小鼠,用ELISA、IFA检测免疫小鼠血清,均检测到抗体。

关键词：鸡贫血病毒 vp1基因 vp2基因真核表达毕赤酵母

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分子佐剂C3d增强猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的研究

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 814-820页

作者：李国新郑宝亮金媛媛田志军周艳君童光志东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 郑州牧业工程高等专科学校生物工程系河南郑州450011 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

为了探讨分子佐剂C3d对猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影响,本研究构建了3种表达不同形式HA的重组质粒,分别为:表达分泌型HA的质粒p-sHA、表达全长HA的质粒p-tmHA和融合表达3拷贝鼠C3d与HA的质粒p-sHA/mC3d3。3种质粒与空载体pCAGGS分... 详细信息

为了探讨分子佐剂C3d对猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影响,本研究构建了3种表达不同形式HA的重组质粒,分别为:表达分泌型HA的质粒p-sHA、表达全长HA的质粒p-tmHA和融合表达3拷贝鼠C3d与HA的质粒p-sHA/mC3d3。3种质粒与空载体pCAGGS分别免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA和HI试验检测抗体水平。结果显示,免疫后第8周,p-sHA组与p-tmHA组的抗体水平没有明显差别,而p-sHA/mC3d3免疫组的抗体水平显著高于这两组,说明分子佐剂C3d增强了抗体应答水平。淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测实验结果显示,免疫后第8周,p-tmHA诱导了更强的淋巴细胞增殖反应和更高水平的IFN-,而p-sHA/mC3d3诱导了更高水平的IL-4,说明HA表达形式的变化影响了免疫反应的类型,C3d与HA融合后通过诱导IL-4的产生而使免疫反应倾向于Th2型。总之,本研究证实3拷贝分子佐剂C3d与分泌型HA融合后显著提高了DNA疫苗诱导的抗体水平。这提示质粒p-sHA/mC3d3免疫可能对接种动物提供高水平的保护,有希望成为抗猪流感病毒的候选疫苗。

关键词：猪流感病毒 DNA疫苗分子佐剂 C3d

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鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LDL05Ⅱ的分离鉴定及生物学特性

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中国兽医学报 2008年第8期28卷 883-887页

作者：马亚珍李晓华韩宗玺邵昱昊聂磊龚利洋张庆霞孙怀刚冉多良刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 大连韩伟养鸡有限公司辽宁大连116043 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

采取2005年大连某鸡场发病鸡群萎缩的输卵管进行处理,经鸡胚尿囊腔接种SPF鸡胚,分离到1株病毒。通过致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率等方面的研究,发现病毒经鸡胚传毒至第... 详细信息

采取2005年大连某鸡场发病鸡群萎缩的输卵管进行处理,经鸡胚尿囊腔接种SPF鸡胚,分离到1株病毒。通过致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率等方面的研究,发现病毒经鸡胚传毒至第3代可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲且大腿及尾部有点状出血;病毒囊液不凝集鸡的外周血红细胞;在电镜下呈球形,病毒囊膜表面有疏松排列的棒状纤突,具有冠状病毒粒子的形态特征;以105.5×EID50/0.1mL的病毒接种15日龄的SPF雏鸡,鸡群发病率为22/22(100%),死亡率为12/22(54.5%)。根据以上结果确定该病毒为冠状病毒,命名为CK/CH/LDL05Ⅱ。在此基础上,用RT-PCR对CK/CH/LDL05Ⅱ的核蛋白基因进行了克隆、测序和分析。与GenBank中26株IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较分析,发现该毒株与我国2004年分离IBV毒株CK/CH/LDL/04Ⅱ的N基因推导氨基酸同源性最高(97.5%),表明两者具有较近的亲缘关系。这一结果不但从分子水平证实毒株CK/CH/LDL05Ⅱ是鸡传染性支气管炎病毒,而且表明该血清型的毒株最近连续2年存在于大连市的不同鸡场。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定核蛋白基因

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传染性法氏囊新城疫病毒二联疫苗株接种后气管黏膜损伤研究

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江西农业大学学报 2008年第6期30卷 951-955页

作者：董俊斌马学恩步志高内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了研究传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒(rlasota-vp2)二联疫苗株的免疫机制,用rlasota-vp2免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在接种后的1,3,5,10,15,18 d取气管,进行光镜、电镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气... 详细信息

为了研究传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒(rlasota-vp2)二联疫苗株的免疫机制,用rlasota-vp2免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在接种后的1,3,5,10,15,18 d取气管,进行光镜、电镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;光镜观察发现,接种后第3 d黏膜下层水肿,淋巴细胞、巨噬细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层有数层不成熟的细胞组成;接种后第10 d,腺体腔闭塞。免疫组化染色(IHC)气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。电镜观察发现接种rlasota-vp2后第3 d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3 d杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露到表面;接种后第10 d,可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18 d,纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。这说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。

关键词： VP2基因重组新城疫病毒气管黏膜损伤

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马传染性贫血病毒受体基因的原核表达

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黑龙江畜牧兽医 2008年第6期 14-16页

作者：张淑琴罗军荣刘霄卉杨旭艳马学恩周建华内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化***21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分... 详细信息

为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化***21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分析鉴定,结果表明:该基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,其表观分子质量约为39.6ku;利用尿素洗涤纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。

关键词： EIAV ELR1 原核表达

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新城疫病毒接种后气管黏膜损伤研究

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江西农业大学学报 2008年第3期30卷 390-394页

作者：董俊斌步志高马学恩内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了研究新城疫弱毒疫苗的免疫机理,用rlasota(重组lasota野毒株)免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在第1,3,5,7,15,18 d取气管,进行电镜、光镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;结果发现rlasota接种后第1 d纤毛细胞有脱纤... 详细信息

为了研究新城疫弱毒疫苗的免疫机理,用rlasota(重组lasota野毒株)免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在第1,3,5,7,15,18 d取气管,进行电镜、光镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;结果发现rlasota接种后第1 d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3 d杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露到表面;接种后第7 d,可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18 d,纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。光镜观察结果发现,接种后第5 d黏膜下层水肿,淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层有数层不成熟的细胞组成;接种后第7 d,腺体腔闭塞。免疫组化染色气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。这说明气管黏膜的损伤可能是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。

关键词：气管黏膜损伤接种新城疫病毒

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鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 17-20页

作者：杨德全李雁冰施建忠陈化兰张书霞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对... 详细信息

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性，且致死率达100％。HA基因与SCK／ST／475／04的同源率最高，而NA基因与Ck／GD／178／04同源率最高。进化分析结果表明，此毒珠与DK／Chi—na／E319-2／03的HA、NA亲缘关系较近，推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-，具有典型高致病性禽流感的特征序列；NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。

关键词：禽流感病毒 1-15N1亚型致病性血凝素神经氨酸酶序列分析

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Asial型口蹄疫病毒感染性克隆的建立

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中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 915-919页

作者：王海伟涂亚斌周国辉杨德成张亚科于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建Asial型口蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescriptⅡSK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21细... 详细信息

为构建Asial型口蹄疫病毒Asial/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescriptⅡSK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21细胞,转染细胞中出现明显的细胞病变。RT-PCR结合序列分析表明,拯救病毒中作为人工设计的分子标记PstⅠ酶切位点被消除,因此,排除了亲本病毒污染的可能。该感染性克隆的构建,为深入探讨Asia1型口蹄疫病毒的致病机理以及新型疫苗的研制奠定了基础。

关键词： DNA 互补/遗传学感染基因组口蹄疫病毒逆转录聚合酶链反应遗传学技术质粒转染人类

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PRRSV国内流行毒株的分离鉴定及结构基因的分析

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动物医学进展 2008年第6期29卷 43-50页

作者：马平石文达刘永刚蔡雪辉王洪峰王淑杰李成君张琪中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从国内发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病料中,分离到8株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。病毒分离培养表明,JS1-JS5第1代即可适应Marc-145细胞。GD1-GD3经Marc-145细胞3次-4次传代后出现明显的细胞病变。间接免疫荧光试验... 详细信息

从国内发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病料中,分离到8株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。病毒分离培养表明,JS1-JS5第1代即可适应Marc-145细胞。GD1-GD3经Marc-145细胞3次-4次传代后出现明显的细胞病变。间接免疫荧光试验表明,8个分离毒株与抗PRRSV抗体均可出现特异性的胞浆荧光。它们对氯仿、甲醛、酸和碱均敏感。5-溴-2′-脱氧尿核苷对其无抑制作用。参照GenBank中已发表的PRRSV的序列设计了两对特异性引物,分别对所分离毒株进行部分nsp2基因和结构基因的扩增。发现JS1-JS5nsp2基因发生了部分缺失。选择JS1、JS5、GD3进行nsp2基因和结构基因的扩增和测序。序列分析结果表明,JS1、JS5和2006年以后国内分离到的高致病性PRRSV高度同源。GD3的Nsp2基因虽然没有发生第534位-第562位氨基酸的缺失,但与2006年以后分离的毒株一样,发生了第482位氨基酸的缺失。通过对3个分离毒株与其他国内分离毒株的结构基因序列进行系统进化分析发现,我国的PRRSV流行毒株可大致划分为两个亚型,JS1、JS5、GD3、CH-1a、JXA1、HUN4、SHH等属于一个亚型,BJ-4、CC-1属于另一个亚型。亚型间核苷酸序列同源性为91.2%-91.8%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株分离鉴定结构基因

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Fowlicidins及其功能研究

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动物医学进展 2008年第3期29卷 54-59页

作者：史春林石星明王云峰王玫孙妍童光志东北农业大学研究生院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

Fowlicidins是鸡体内的一类新型的Cathelicidin抗菌肽,其前体分子的氨基端含有一个高度保守的cathelin前片段,而羧基端的氨基酸序列具有特异性。它们有广谱的抗菌活性,具有避免抗菌剂耐药性的潜能,是理想的候选抗菌药物。

关键词： Cathelicidin Fowlicidin 抗菌活性重组表达

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