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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会

作者：王秀荣于康震刘丽玲乔传玲石锐孙凯孔宪刚陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究.通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒.从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片.待检病毒样品用TrozolLS提取RNA,反转录过... 详细信息

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究.通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒.从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片.待检病毒样品用TrozolLS提取RNA,反转录过程中用Cy5标记样品cDNAs.将标记样品与芯片杂交,扫描芯片上待检样品与芯片上捕捉探针的结合位点,杂交信号与预期设想一致.结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV血凝素亚型鉴别诊断方法。

关键词：禽流感病毒基因芯片检测血凝素亚型鉴定 RT-PCR 鉴别诊断

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镉致鸡脾淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响

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中国环境科学 2004年第4期24卷 456-459页

作者：李金龙徐世文熊永忠李术王秀荣东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

应用吖啶橙/溴化乙锭荧光染色(AO/EB)法、DNA琼脂糖凝胶电泳及半定量RT-PCR法检测了氯化镉在浓度0～30μmol/L范围内对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响.结果表明,浓度为0～30μmol/L的镉能引起鸡脾脏淋巴细胞凋亡及... 详细信息

应用吖啶橙/溴化乙锭荧光染色(AO/EB)法、DNA琼脂糖凝胶电泳及半定量RT-PCR法检测了氯化镉在浓度0～30μmol/L范围内对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响.结果表明,浓度为0～30μmol/L的镉能引起鸡脾脏淋巴细胞凋亡及干扰p53mRNA的表达,低浓度镉引起的细胞凋亡与p53mRNA的表达密切相关,而高浓度的镉能够导致鸡脾脏淋巴细胞坏死.

关键词：镉鸡脾脏淋巴细胞凋亡坏死 p53mRNA

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鸡传染性支气管炎中国地方分离毒株LX4 mRNA1 ORF1的遗传变异特征

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病毒学报 2004年第4期20卷 347-352页

作者：刘胜旺刘玉芬孔宪刚邵昱昊中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

应用RT-PCR方法扩增了冠状病毒鸡传染性支气管炎中国分离毒株LX4的mRNA1ORF1,并将其进行了克隆、序列测定和分析。表明LX4mRNA1基因包含2个ORF,其中ORF1a由11916个核苷酸组成,编码一条3971个氨基酸残基组成的多肽。ORF1b由7950个核苷酸... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增了冠状病毒鸡传染性支气管炎中国分离毒株LX4的mRNA1ORF1,并将其进行了克隆、序列测定和分析。表明LX4mRNA1基因包含2个ORF,其中ORF1a由11916个核苷酸组成,编码一条3971个氨基酸残基组成的多肽。ORF1b由7950个核苷酸组成,编码2649个氨基酸残基组成的多肽。与美国Beaudette株对应的ORF1a核苷酸及推导的氨基酸序列同源性均为85%,与对应的ORF1b的同源性分别为89%和95%。二者ORF1a和ORF1b重叠区推测的"滑脱序列"(slipperysequence)核苷酸序列一致,"假结"(pseudoknot)基本结构相似。不同之处在于"假结"第2环中LX4的第7位为A,而Beaudette株在该位置为G。与Beaudette株比较,LX4ORF1a核苷酸变异最频繁的区域集中在第2656～3098位碱基处,且在该区域有60个碱基的插入,导致推导的氨基酸序列插入了20个氨基酸残基。LX4ORF1b序列缺失9个核苷酸,主要集中在第5168～5181位之间,导致对应的氨基酸缺失3个。但这些差异是否与病毒的生物学特性有关不明。

关键词：核苷酸 4mRNA 分离毒株氨基酸残基列缺多肽冠状病毒鸡传染性支气管炎遗传变异同源性

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禽流感病毒N3亚型神经氨酸酶基因的克隆

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中国预防兽医学报 2004年第3期26卷 161-164页

作者：邓国华王秀荣张立春刘振勇乔传玲田国彬于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT＿PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18＿T载体上,并进行鉴定和序列测定。测... 详细信息

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT＿PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18＿T载体上,并进行鉴定和序列测定。测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致。根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基。与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶 N3 NA基因克隆

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猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

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中国预防兽医学报 2004年第4期26卷 252-255页

作者：闫丽萍周艳君仇华吉魏萍童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

从健康仔猪前腔静脉无菌采血 ,分离外周血单个核细胞 ,提取细胞总RNA ,用猪γ干扰素 (IFN_γ)基因特异性引物通过RT_PCR扩增猪IFN_γ的全长cDNA序列 ,将其克隆到pMD18_T载体中 ,再亚克隆到pUC18和表达载体pET_30a中 ,经测序发现其序列与... 详细信息

从健康仔猪前腔静脉无菌采血 ,分离外周血单个核细胞 ,提取细胞总RNA ,用猪γ干扰素 (IFN_γ)基因特异性引物通过RT_PCR扩增猪IFN_γ的全长cDNA序列 ,将其克隆到pMD18_T载体中 ,再亚克隆到pUC18和表达载体pET_30a中 ,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN_γ基因序列基本一致。将重组质粒pET_30a_IFN_γ转化大肠杆菌BL2 1,于 37℃经IPTG诱导表达 ,IFN_γ基因获得表达 ,表达产物以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白的 39%。经SDS_PAGE及Westernblot分析表明 ,表达的融合蛋白分子量约为 2 5ku。将包涵体用 8mol/L脲变性 ,用ProBondTMPurificationSysterm纯化 ,经透析复性 ,得到纯化的目的蛋白 ,含量可达 0 3mg/mL。将复性蛋白免疫新西兰白兔三次 ,制备了高滴度的猪IFN_γ抗血清。本实验表达和纯化了猪IFN_γ ,并制备兔抗猪IFN_γ的抗血清 ,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础。

关键词：猪γ干扰素重组细胞因子抗血清

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鸡传染性支气管炎病毒国内分离株D971 mRNA_3和mRNA_4 cDNA的分子特征

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中国兽医学报 2004年第2期24卷 122-125页

作者：刘玉芬刘胜旺荣骏弓孔宪刚刘宝全中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV)基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,经 RT-PCR扩增得到了 IBV国内分离株 D971约 1.3kb的片段 ,其中包含 3a、3b、E及 M蛋白基因的完整 ORF,并将该片段进行了克隆和序... 详细信息

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV)基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,经 RT-PCR扩增得到了 IBV国内分离株 D971约 1.3kb的片段 ,其中包含 3a、3b、E及 M蛋白基因的完整 ORF,并将该片段进行了克隆和序列测定。与国内外部分 IBV毒株序列比较表明 :D9713a基因与 CU- T2、D14 6 6、DE0 72、M4 1、GA/99和 UK/6 6的 3a基因核苷酸序列同源性在 83%～ 89%之间 ,氨基酸序列同源性为 77%～ 91% ,其中与 CU- T2毒株的同源性最低 (分别为 83%和 77% ) ;3b基因与上述毒株的对应核苷酸序列同源性在 85 %～ 95 %之间 ,氨基酸序列同源性为 72 %～ 96 % ,与 CU- T2的同源性最高 (分别为 95 %和 96 % ) ;E蛋白基因与 CU- T2、D14 6 6、DE0 72、M4 1、Ark99、H5 2、Gray、GA/99和 UK/6 6的核苷酸序列同源性在 81%～ 86 %之间 ,氨基酸序列同源性为 74 %～ 80 %。不同毒株推导的 E蛋白 C末端表现不同特征 ,其中 D971E蛋白 C末端比 CU- T2的对应区多 9个氨基酸残基 ,而比本试验选用的其他参考毒株的相应区域短 5～ 7个氨基酸残基。M基因与 CU - T2、DE0 72、Gray、M4 1、H12 0、H5 2、SD/97/0 2、L X4及D4 1的 M基因核苷酸序列同源性在 86 %～ 91%之间 ,氨基酸序列同源性为 85 %～ 95 % ,其?

关键词：鸡传染性支气管炎病毒国内分离株 mRNA cDNA 分子特征

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禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

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中国兽医科技 2004年第6期34卷 52-55页

作者：冉多良施建忠孟庆文新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷... 详细信息

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His+Mut+表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。

关键词：禽流感病毒巴斯德毕赤酵母 NA基因分泌表达

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禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立

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中国兽医科技 2004年第4期34卷 9-13页

作者：王秀荣李冬梅邓国华田国彬姜永萍李呈军刘丽玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358bp、377bp。经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/Africanstarling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符。经对国内不同地区分离的16株AIVN1亚型和21株AIVN2亚型用RT PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50)。

关键词：禽流感病毒亚型鉴别反转录聚合酶链反应神经氨酸酶 RT-PCR

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禽流感病毒N4亚型神经氨酸酶基因的克隆和序列分析

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中国兽医学报 2004年第3期24卷 212-215页

作者：王秀荣邓国华姜永萍乔传玲田国斌刘丽玲于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 农业部畜牧兽医局

应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒 A/ Turkey/ Ontario/ 6 118/ 6 8(H8N4 )毒株 ,Tri Zol L S Reagent提取病毒 RNA,RT- PCR扩增神经氨酸酶 (NA)基因全片段 ,克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了鉴定和序列测定。所获得的 NA基... 详细信息

应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒 A/ Turkey/ Ontario/ 6 118/ 6 8(H8N4 )毒株 ,Tri Zol L S Reagent提取病毒 RNA,RT- PCR扩增神经氨酸酶 (NA)基因全片段 ,克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了鉴定和序列测定。所获得的 NA基因片段长 14 4 1bp,编码 4 90个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列进行预测 ,有 9个潜在的糖基化位点和2

关键词：禽流感病毒 N4亚型神经氨酸酶基因克隆序列分析鸡群生物学特征

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新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

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中国兽医科技 2004年第6期34卷 25-29页

作者：刘芳宁闫丽辉曹殿军刘培欣杨增岐张淑霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用... 详细信息

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。

关键词：新城疫病毒 L基因克隆序列分析

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