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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：田秋丰于申业衣菲吕雪莲倪宏波刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

单核细胞增生李斯特茵的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能.为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与EGFP或DsRed基因分别插入到pET28a和pUC19载体中,构建pET-p... 详细信息

单核细胞增生李斯特茵的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能.为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与EGFP或DsRed基因分别插入到pET28a和pUC19载体中,构建pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed重组质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况.结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体茵中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达.本研究成功构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台.

关键词：单核细胞增生李斯特茵调控基因温控表达荧光蛋白载体构建

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表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对小鼠的免疫原性研究

表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：马良王琪田美杰王喜军翟洪月于文会葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克... 详细信息

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克隆到载体pBRN-FL-Pmel上,构建了表达狂犬病病毒糖蛋白重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-ERA-GP.利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,拯救重组病毒***-PCR检测证实重组病毒rLa-ERA-GP基因组中含有GP基因;western blot和IFA检测结果均表明GP基因在新城疫载体中得到了正确、稳定的表达;大剂量接种BALB/c小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞,并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应;加强免疫后可有效抵御致死剂量RV街毒对BALB/c小鼠的攻击.重组病毒rLa-ERA-GP有望成为防制狂犬病更加安全、有效的,新型重组基因工程活载体疫苗.

关键词：狂犬病病毒反向遗传操作系统重组新城疫病毒糖蛋白表达活载体疫苗免疫原性

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腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2最早提供完全攻毒保护时间的研究

腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2最早提供完全攻...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：袁晋孙元王春花秦华洋丛鑫李素罗玉子刘磊仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度传染性、致死性猪传染病,对养猪业危害极大.目前,疫苗接种仍然是防控该病的重要措施.猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)在猪瘟防控中发挥了重要作用,但由于其缺乏鉴别疫苗接种和野毒感染的特性,不利于猪瘟的... 详细信息

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度传染性、致死性猪传染病,对养猪业危害极大.目前,疫苗接种仍然是防控该病的重要措施.猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)在猪瘟防控中发挥了重要作用,但由于其缺乏鉴别疫苗接种和野毒感染的特性,不利于猪瘟的根除和净化,因此研制具有标记特性的新型猪瘟疫苗具有重要意义.此前,本实验室构建了一种腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2,该疫苗不但具有标记特性,而且免疫效力与C株疫苗相当,且在多方面弥补了C株的不足.本研究拟进一步评价该嵌合载体猪瘟疫苗最早提供完全攻毒保护的时间.将rAdV-SFV-E2免疫猪瘟抗原和抗体均为阴性的健康仔猪(n=5),免疫一次后于不同时间点用CSFV强毒石门株进行攻击,并检测其抗体应答、临床症状、病毒血症和病理变化等.结果显示,rAdV-SFV-E2免疫后1周和2周,分别能对致死性CSFV强毒的攻击提供部分保护(3/5存活)和不完全保护(全部存活,但出现了短暂的发热和低水平的病毒血症);免疫后3周和4周,能够完全抵抗致死性CSFV强毒的攻击,表现为无病毒血症,无临床症状,无剖检变化和组织病理学变化.此研究进一步证实了腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2作为种新型猪瘟标记疫苗的可能性,在猪瘟的紧急防控中也能够起到一定的作用.

关键词：猪瘟嵌合载体疫苗最早保护时间腺病毒甲病毒复制子嵌合载体

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一株新奇的抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体识别B细胞表位的鉴定及应用

一株新奇的抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体识别B细胞表位的鉴定及应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：杨玉菊郑楠符芳柴政姜福成王香玲张雪云王卓李曦哈尔滨学院黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319 哈尔滨师范大学黑龙江哈尔滨150080

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot 结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫... 详细信息

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot 结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb所识别蛋白为ATP结合盒转运蛋白(ABCT)家族的寡肽透过酶(OppA);利用MAb对噬茵体12肽库进行淘选,8个阳性噬菌体克隆展示有"KTPAE-R"保守序列,对应于*** SH29755株和SH0165株的469位～475位的氨基酸残基.对OppA氨基酸序列比对结果表明***与其它10种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1％～74.5％,本研究结果为进一步研究***感染的病原学诊断建立了良好的基础.

关键词：副猪嗜血杆菌单克隆抗体 B细胞表位病原学诊断

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表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与评价

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与评价

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：陈普成李奇蒙姜永萍柳金雄田雨王笑梅胡永浩陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR扩增IBDV的VP2基因,构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并将携带Pec复合启动子的VP2基因表达盒(Pec-VP2-PolyA)进行酶切,连接于Gateway系统入门质... 详细信息

为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR扩增IBDV的VP2基因,构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并将携带Pec复合启动子的VP2基因表达盒(Pec-VP2-PolyA)进行酶切,连接于Gateway系统入门质粒pENTR构建重组质粒pENTR-VP2.采用GatewayLR克隆技术将pENTR-VP2与构建的重组粘粒pFosC-ccdBK+共同参与基因片段进行互换反应,构建重组粘粒pFosC-VP2.通过将pFosC-VP2与其它4个相互重叠并且覆盖HVT全基因组的粘粒酶切线性化后共同转染CEF细胞,拯救重组病毒rHVT-VP2.将重组病毒在CEF细胞中连续传代20次,利用PCR、western blot和间接免疫荧光进行检测,结果表明VP2蛋白均得到稳定地表达.动物试验结果表明通过一次免疫rHVT-VP2即可诱导针对传染性法氏囊的完全保护力.

关键词：火鸡疱疹病毒传染性法氏囊病毒基因重组蛋白表达

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野鸭源禽网状内皮组织增生症病毒的分离与鉴定

野鸭源禽网状内皮组织增生症病毒的分离与鉴定

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辽宁省畜牧兽医学会2014年学会年会

作者：姜莉莉祁小乐高玉龙邓小芸柴洪亮张礼洲贠炳岭秦立廷王永强高宏雷王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨 150040 辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州 12 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨 150040

本研究利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的特异性引物作为检测引物,对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测.阳性样品经DF1培养增殖,进行病毒的分离,经PCR和间接免疫荧光(IFA)方法鉴定,确定分离到2... 详细信息

本研究利用扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的特异性引物作为检测引物,对采集于吉林省某地健康野鸭的脏器样品进行PCR检测.阳性样品经DF1培养增殖,进行病毒的分离,经PCR和间接免疫荧光(IFA)方法鉴定,确定分离到2株REV,分别来自于针尾鸭和绿头鸭将分离病毒分别命名为DBYR1101和DBYR1102.克隆两个病毒株的主要保护性抗原基因gp90,并进行序列分析.结果显示,两个分离株gp90基因氨基酸同源性为99.5％;DBYR1101gp90基因与REV3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸同源性分别为95.7％、94.2％和98.2％;DBYR1102gp90基因与REV3个型的代表株170A、SNV和CSV的氨基酸同源性分别为95.2％、93.7％和97.7％;与我国早期南方分离株HA9901的氨基酸序列同源性分别为94.7％和94.2％;与我国北方分离株氨基酸序列同源性为99.2％～100％.核苷酸遗传进化分析表明,2个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近,趋于形成一个北方分离群;与SNV株亲缘关系最远;与170A株亲缘关系较远;与美国和中国台湾地区的某些分离株同源性较高.该研究首次自野鸭体内分离到REV,丰富了REV流行病学资料,同时提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色,为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定了基础.

关键词：野鸭禽网状内皮组织增生病病毒分离菌株鉴定

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辽宁省某市奶牛布病感染状况及群间传播风险因素调查

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中国动物检疫 2014年第11期31卷 51-54页

作者：崔基贤王靖飞谷志大辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁省动物医学研究院辽宁沈阳110164 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/疫病诊断中心黑龙江哈尔滨150001

为了解辽宁省某市的奶牛布鲁氏菌病(简称奶牛布病)流行现状及该市奶牛布病群间传播风险因素,开展本研究。对该市辖区内所有奶牛进行布鲁氏菌病的普查,获知该市奶牛布病的表观个体血清流行率和表观群血清流行率;采用问卷调查方式进一步... 详细信息

为了解辽宁省某市的奶牛布鲁氏菌病(简称奶牛布病)流行现状及该市奶牛布病群间传播风险因素,开展本研究。对该市辖区内所有奶牛进行布鲁氏菌病的普查,获知该市奶牛布病的表观个体血清流行率和表观群血清流行率;采用问卷调查方式进一步开展病例-对照研究,初步筛选出14项该市奶牛布病群间传播可能风险因素,经相关性检验结合生物学知识,选取了5个变量进入多因素分析,最终通过非条件logistic回归方法初步建立了该市奶牛布病群间传播风险因素回归模型,并建立ROC曲线计算了模型的预测概率。研究结果显示,该市奶牛个体流行率为0.99%,群流行率12.44%。非条件logistic回归分析结果显示,该市奶牛布病群间传播的风险因素包括:"无专用购销车辆"(OR=3.57,95%CI:1.04-12.5,p=0.04),"进圈时不穿专用工作服和胶靴"(OR=5.0,95%CI:0.97-25.00,p=0.06),"与犬混养"(OR=12.39,95%CI:0.97-157.56,p=0.05)。该结果表明与犬混养可能是该市奶牛布病群间传播重要的风险因素,而奶牛销售时自有购销专用车辆和场内生物安全措施的采取如进圈穿专用工作服可使奶牛布病在场群间传播的风险降低。针对回归模型建立的ROC曲线下面积为71.6%,表明此模型解释该市奶牛布病群间传播风险的能力为中等。

关键词：奶牛布鲁氏菌病流行率风险因素

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胸膜肺炎放线杆菌血清7型S8△clpP/△apxⅡC双基因缺失弱毒株的构建及其生物学特性

胸膜肺炎放线杆菌血清7型S8△clpP/△apxⅡC双基因缺失弱毒株的构...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：谢芳周泷李刚张艳禾刘娇崔宁王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的一种重要病原菌.为进一步降低其毒力以制备基因缺失弱毒疫苗,本研究以本实验室构建的APP血清7型sg菌株基因缺失株S8△clpP为亲本株,通过同源重组和蔗糖负向筛选的方法,敲除了ApxⅡ溶血素... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的一种重要病原菌.为进一步降低其毒力以制备基因缺失弱毒疫苗,本研究以本实验室构建的APP血清7型sg菌株基因缺失株S8△clpP为亲本株,通过同源重组和蔗糖负向筛选的方法,敲除了ApxⅡ溶血素激活基因apxⅡC,构建了无抗生素标记的双基因缺失突变株S8△clpP/△apxⅡC.生物学特性结果显示,双基因缺失株仔生长速率没有明显改变,但溶血活性完全消失,结果表明双基因缺失株Sg△clpP/△apxⅡC可作为APP基因缺失弱毒活疫苗的候选株.

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌基因缺失血清分析型毒株构建生物学特性

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胸膜肺炎放线杆菌血清7型S8ΔclpP/ΔapxⅡC/Δfur三基因缺失弱毒株的构建及生物学特性研究

胸膜肺炎放线杆菌血清7型S8ΔclpP/ΔapxⅡC/Δfur三基因缺失弱毒...

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四川省畜牧兽医学会2014学术年会

作者：周泷谢芳刘娇崔宁李艳玲牛惠李刚张艳禾王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的一种重要病原菌.为进一步致弱其毒力,制备基因缺失弱毒疫苗,本研究以本实验室构建的APP血清7型S8菌株双基因缺失株S8△clpP/△apxⅡC为亲本株,通过同源重组和蔗糖负向筛选的方法,再将铁... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的一种重要病原菌.为进一步致弱其毒力,制备基因缺失弱毒疫苗,本研究以本实验室构建的APP血清7型S8菌株双基因缺失株S8△clpP/△apxⅡC为亲本株,通过同源重组和蔗糖负向筛选的方法,再将铁摄取调节基因fur缺失,构建了无抗生素标记的三基因缺失突变株S8△clpP/△apxⅡC/fur.生物学特性研究表明,该缺失株与野生株S8相比,体外生长速度未发生明显变化,但溶血能力显著下降,与亲本株相比,铁摄取利用轻微降低.致病力试验结果表明,仔猪经气管接种该缺失株毒力显著低于野生型菌株,并且1×109CFU/mL剂量对猪不产生明显的呼吸道症状和肺部病变,表明该缺失株高度安全,可作为APP基因缺失弱毒活疫苗的候选株.

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌基因缺失弱毒疫苗生物学特性

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猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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2014年中国畜牧兽医学会养猪学分会学术研讨会

作者：王香玲柴政田华彬符芳姜福成郑楠张雪云郭佃磊李昆鹏李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨 150025 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆 163319

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保... 详细信息

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保存的猪源抗体恒定区连接.通过Linker序列[(Gly4Ser)3],最终将重链和轻链连接,构成H-linker-L.将该序列连接到原核表达载体pET-28a进行原核表达,纯化.Western-blot鉴定结果表明,该重组蛋白能够与兔抗猪IgG二抗反应.这说明构建的重组抗体确实为猪源抗体.

关键词：猪源抗体基因克隆大肠杆菌 B淋巴细胞

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