检索结果-内蒙古大学图书馆

中国实验动物学报 2019年第2期27卷 200-207页

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELIS... 详细信息

目的制备鸭抗原处理相关转运体(TAP)特异性单抗,为深入利用实验鸭开展免疫学研究提供实验材料。方法利用大肠埃希菌诱导表达主要组织相容性复合体(MHC)单倍型HBW-SPF鸭TAP蛋白肽结合区片段,表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠,采用ELISA技术筛选特异性单抗分泌杂交瘤细胞株。将阳性细胞株制备小鼠腹水,作为一抗,与多次截短表达TAP蛋白肽结合区进行蛋白免疫印迹试验,鉴定单抗针对的抗原表位。通过间接免疫荧光试验比较该单抗对实验鸭和鸡外周血淋巴细胞的反应性,利用免疫组织化学技术检测对SPF鸡、SPF鸭、鹌鹑、鹅和SPF猪的特异性。结果获得一株鸭TAP单抗1A6,抗原表位位于^(297)NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI^(322),对鸡和鸭外周血淋巴细胞具有免疫荧光反应性;在鸡和鸭的肠黏膜固有层检测到大量特异性信号,在猪、鹌鹑和鹅没有检测到信号。结论获得了一株具有鸡和鸭反应性的抗原转运相关体特异性的单抗,可运用于禽类实验动物在禽病学和禽免疫学方面的研究。

关键词：主要组织相容性复合体单倍型鸭抗原处理相关转运体单克隆抗体特异性

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MDA5基因敲除小鼠的构建

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新疆农业大学学报 2020年第4期43卷 270-274页

作者：田璐张子博史鑫琪郭慧娟陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

MDA5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进Ⅰ型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠MDA5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的s... 详细信息

MDA5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进Ⅰ型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠MDA5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的sgRNA和Cas9质粒的体外转录产物显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,8只F0代首建鼠中5号小鼠为MDA5基因敲除纯合小鼠;将其与野生型(WT)小鼠合笼繁育出MDA5^(+/-)小鼠,再通过全同胞合笼交配的方式获得纯合子小鼠。基因组PCR后检测显示F2代小鼠中有4只纯合小鼠,进一步RT-PCR结果显示MDA5敲除小鼠各脏器中MDA5基因均未表达,表明基于CRISPR/Cas9技术的MDA5基因敲除小鼠模型构建成功。为进一步研究MDA5在天然免疫应答机制和抗病毒感染等方面提供有价值的模型。

关键词： MDA5 CRISPR/Cas9 基因敲除动物模型

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STAT3在猪流行性腹泻病毒感染的作用及机制初步探索

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中国兽医杂志 2019年第7期55卷 3-7页

作者：杨丽君张健许嘉宇张璐冯力陈洪岩王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探究信号传导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染过程中的作用,采用STAT3特异性siRNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和Western Blot试验显示,其能够明显降低STAT3的mRNA水平和蛋白水平;在此条件下接种PEDV,通过荧光定量PCR试验,显示当STAT3的mRNA水平降低时能够显著抑制PEDV的RNA水平,Western Blot试验结果也证实抑制STAT3内源性表达能够显著抑制PEDV复制。为进一步研究STAT3的作用机制,采用STAT3特异性siRNA处理这两种细胞,24 h后经过荧光定量PCR检测发现敲低STAT3后,干扰素刺激基因MxA、ISG15以及IFN-β,IFN-λ的mRNA水平均显著升高。本研究对于进一步阐明STAT3参与PEDV感染引发的IFN抗病毒反应提供了试验依据。

关键词： STAT3 PEDV IFN

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实验用SPF大白猪和长白猪母系遗传结构分析

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农业生物技术学报 2019年第1期27卷 97-107页

作者：辛畅高彩霞权金强马璐璐陈洪岩东北农业大学生命科学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪作为重要的实验动物,其遗传学质量控制研究十分必要。为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(displacement-loop region, D-loop区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对。结果显示,107个样本中共检测到40个多态位点,分为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4。两猪群中各存在1个优势单倍型。单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503。此外,中介网络关系图和系统进化树发现大白猪和长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近。本研究表明实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构。研究结果有利于进一步的实验动物标准化以及遗传质量控制研究。

关键词：无特定病原体(SPF)猪 mtDNA 控制区母系遗传结构

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敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

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中国动物传染病学报 2019年第5期27卷 14-21页

作者：许曼黄立平邵玉乐夏德利曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑视黄酸诱导基因Ⅰ信号通路 PK-15 猪圆环病毒2型

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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

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中国家禽 2019年第11期41卷 12-17页

作者：曾为俊许曼王辉鲁国涛邵玉乐陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株... 详细信息

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

关键词： RIG-I CRISPR/Cas9 MDCK细胞系基因敲除 H9N2亚型流感病毒

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利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

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中国兽医科学 2019年第9期49卷 1128-1135页

作者：邵玉乐许曼王辉曾为俊鲁国涛赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检... 详细信息

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。

关键词： TLR3 MDCK CRISPR/Cas9 新城疫病毒

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TLR4^-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究

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中国预防兽医学报 2019年第12期41卷 1244-1250页

作者：王辉鲁国涛许曼曾为俊邵玉乐赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF... 详细信息

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。

关键词： TLR4 CRISPR/Cas9系统 DF1 基因敲除 NDV

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自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

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病毒学报 2019年第6期35卷 888-894页

作者：刘鑫王斌姚晓雨郑永辉范春玲黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆 163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所‐美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨 150001

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研... 详细信息

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P<0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。

关键词：自噬(Autophagy) 自噬相关基因3(Atg3) 埃博拉病毒(EBOV) 囊膜蛋白(GP)

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2017年我国4个省份屠宰场猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国预防兽医学报 2019年第12期41卷 1210-1214页

作者：王长珍刘文宇祝瑶栾天于淼杨亲刘思国张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨市产品质量监督检验院黑龙江哈尔滨150036

为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方... 详细信息

为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方法检测分离菌的耐药基因和毒力基因;通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析不同来源分离株间的亲缘关系。结果显示,从4省市共分离到猪链球菌46株,包括12种血清型和3种荚膜新型血清型,其中猪链球菌血清7型分离率最高,为30.4%,但不同地区血清型交叉密度较低。分离菌株表现出广泛耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、多西环素的耐药率较高,分别为91.30%、86.96%、86.96%,但分离株均对万古霉素敏感。红霉素类耐药基因erm和四环素类耐药基因tet的检出率均较高,其中erm(B)为97.83%,tet(O)为89.13%。PFGE结果显示不同地区分离菌株PFGE谱型差异明显,而同一地区分离菌株PFGE谱型相似或相同,提示同一地区猪链球菌存在克隆传播现象。本研究揭示了我国不同地区猪链球菌流行情况,为猪链球菌病的防控提供参考依据。

关键词：猪链球菌流行病学耐药 PFGE

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