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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定... 详细信息

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况.结果显示：成功筛选到两株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(Wildtype,WT)相比形成细胞单层的时间明显延长(P＜0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染实验表明：模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加.本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得两株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定了基础.

关键词： DDX21基因 H9N2亚型禽流感病毒 CRISPR/Cpf1 HEK293细胞基因敲除

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疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已... 详细信息

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已报道的疱疹病毒针对TAP介导的病毒肽转运过程和MHC Ⅰ类分子介导的病毒肽递呈过程的干扰，做一简单综述，希望对其他尚未阐明免疫逃避机制的疱疹病毒的研究有所帮助。

关键词：疱疹病毒抗原处理相关转运体(TAP) 主要组织相容复合体(MHC)Ⅰ类分子免疫逃避

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STAT3在猪流行性腹泻病毒感染的作用及机制初步探索撤回

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中国预防兽医学报 2018年

作者：杨丽君郭龙军张健许嘉宇张璐冯力陈洪岩王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋... 详细信息

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋白水平;在此条件下接种PEDV,通过荧光定量PCR检测,显示当STAT3的m RNA水平降低时能够显著抑制PEDV的RNA水平,western blot实验结果也显示抑制STAT3内源性表达能够显著抑制PEDV复制。为进一步研究STAT3的作用机制,采用STAT3特异性si RNA处理这两种细胞,24 h后经过荧光定量PCR检测发现敲低STAT3后,干扰素刺激基因Mx A、ISG15以及IFN-β,IFN-λ的m RNA水平均显著升高。本研究对于进一步阐明STAT3参与PEDV感染引发的IFN抗病毒反应提供了实验依据。

关键词： STAT3 PEDV IFN

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天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

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中国兽医科学 2019年第11期49卷 1397-1405页

作者：董志民李秀丽田向学杨春蕾燕晓翠谭世旭张万江刘思国鄢明华天津市畜牧兽医研究所天津300381 农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站天津300381 天津市畜禽健康养殖技术工程中心天津300381 天津市宁河区芦台第一中学天津301500 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌... 详细信息

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CFU/mL,最大值为5.7×10^8 CFU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CFU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。

关键词：猪链球菌9型致病性黏附能力溶血性毒力基因

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利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 958-964页

作者：庞中兵王伟刘赛宝王辉陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR... 详细信息

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 DF1细胞系 TLR4 慢病毒表达载体基因敲除

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马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab’)_2的制备

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中国生物制品学杂志 2019年第2期32卷 173-180页

作者：邱泊宁胡星星闫飞虎王翀崔健男盖微微曹增国王化磊赵永坤杨松涛夏咸柱吉林大学动物医学学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab’)_2。间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率。结果所制备的特异性IgG与特异性F(ab’)2的纯度分别为90. 1%和92. 8%,收率分别为8. 7%和3. 07%;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab’)_2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总Ig G或总F(ab’)_2。结论成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab’)_2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2制备工艺奠定了基础。

关键词：中东呼吸综合征冠状病毒病毒样颗粒免疫亲和层析免疫球蛋白 F(ab’)2

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鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

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中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 67-74页

作者：李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽... 详细信息

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

关键词：鸡卵清蛋白启动子 HA 禽流感病毒免疫保护输卵管生物反应器

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农用实验动物猪感染模型的研究概况

农用实验动物猪感染模型的研究概况

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：王玉娥陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平西路678号 150069

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肠道菌群在宿主免疫应答中的作用及机制研究进展

肠道菌群在宿主免疫应答中的作用及机制研究进展

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：张贺王玉娥陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平西路678号 150069

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鹅源星状病毒衣壳蛋白的原核表达

鹅源星状病毒衣壳蛋白的原核表达

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：蒲路莎苏世博陈肖韩赵丽丽陈洪岩黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆158308 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

应用RT-PCR方法扩增了 GoAstV(Goose astrovirus)编码内衣壳ORF2蛋白的基因2115bp,将ORF2基因克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21中得到了表达.通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了大小约106kDa的ORF2蛋白,与理论值相符.We... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增了 GoAstV(Goose astrovirus)编码内衣壳ORF2蛋白的基因2115bp,将ORF2基因克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21中得到了表达.通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了大小约106kDa的ORF2蛋白,与理论值相符.Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别.本实验利用原核表达系统成功高效地表达了 GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在.

关键词：星状病毒原核表达鹅

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