检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：倪宏波刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮王聃赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7... 详细信息

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用.结果:实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用.结论:pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质,为筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白与肺泡上皮细胞相互作用的蛋白奠定了重要基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性作用

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5种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其初步应用

5种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其初步应用

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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：陈微晶符芳蔡雪辉田志军宋淑萍李曦黑龙江省八一农垦大学黑龙江大庆1631109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究将猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、2型猪圆环病毒(PCV-2)5种病毒核酸的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以5种细胞培养毒的核酸作为模板，进行不对称PCR扩增... 详细信息

本研究将猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、2型猪圆环病毒(PCV-2)5种病毒核酸的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以5种细胞培养毒的核酸作为模板，进行不对称PCR扩增，制备靶物，经绿色荧光染料Cy3标记后，分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交。杂交信号经Genepix4000A扫描仪扫描。结果显示，芯片探针可以分别特异地与Cy3标记的5种特异靶物结合。应用本研究制备的基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测，其中，PRRSV阳性样品26份，PCV-2阳性样品47份，且PRRSV、PCV-2混合感染阳性样品17份，PPV阳性样品5份，PRV阳性样品2份，CS-FV检测阳性样品20份。结果表明，本研究设计并点制的cDNA芯片可以特异的检出5种病毒，具有明确的、潜在的诊断应用性。

关键词：猪病病毒病毒感染免疫学检验基因芯片探针

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鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

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中国科技成果 2009年第21期10卷 8-8页

作者：王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划... 详细信息

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划课题（课题名称：鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗的研制）的支持（2001～2005年）和农业科技成果转化资金项目课题（课题名称：传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二价疫苗）（2001年～2003年）的资助。

关键词：鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗重组鸡痘病毒农业科技成果转化资金项目国家863计划马立克氏病亚单位疫苗病毒载体

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鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因vp1的原核表达及其抗原性分析

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中国预防兽医学报 2008年第8期30卷 618-621页

作者：甘一迪刘家森姜骞孟庆文韩凌霞司昌德曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物中心黑龙江哈尔滨150001

通过RT-PCR方法克隆出DHV-1:161/79/V结构蛋白vp1基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中,测序结果为714bp。vp1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+),获得重组质粒pET-VP1,转入*** Rosetta-gami(DE3) pLysS,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明在大肠杆菌中表达了1个相对分子量约为47ku的融合蛋白(Trx-His-VP1),将此融合蛋白用His-Ni+亲和层析法进行纯化。Western blot分析表明,Trx-His-VP1能与DHV-1阳性血清发生特异性反应,说明表达的结构蛋白VP1具有良好的抗原性。

关键词：鸭肝炎病毒Ⅰ型 vp1基因原核表达

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 200-205页

作者：李娇薛飞朱远茂祖立闯中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到... 详细信息

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白截短表达鉴定

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牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 747-750,754页

作者：马文戈于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ。参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC... 详细信息

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ。参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因。选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析。结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%。由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道。

关键词：多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型分离鉴定

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马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

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中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 510-514页

作者：全滟平沈楠郭巍赵立平周建华沈荣显相文华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎... 详细信息

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。

关键词：马传染性贫血病毒 LTR 基因进化启动子活性

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Asia1型口蹄疫病毒感染性克隆的建立

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中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 915-919页

作者：王海伟涂亚斌周国辉杨德成张亚科于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建Asia1型口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescript II SK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21... 详细信息

为构建Asia1型口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescript II SK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21细胞,转染细胞中出现明显的细胞病变。RT-PCR结合序列分析表明,拯救病毒中作为人工设计的分子标记PstⅠ酶切位点被消除,因此,排除了亲本病毒污染的可能。该感染性克隆的构建,为深入探讨Asia1型口蹄疫病毒的致病机理以及新型疫苗的研制奠定了基础。

关键词： Asial型口蹄疫病毒全长cDNA 体外转录和转染病毒拯救

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犊牛腹泻粪样中牛呼肠孤病毒的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 711-715页

作者：常继涛李鑫张亚科于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株。RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3∶3∶4排列。电镜检测结果显... 详细信息

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株。RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3∶3∶4排列。电镜检测结果显示,病毒粒子呈典型呼肠孤病毒粒子形态,直径约70nm;病毒L1基因保守区段RT-PCR检测及序列分析表明,扩增出的440bp目的片段符合预期大小,而且其核苷酸序列与GenBank参考毒株L1基因序列具有较高同源性;S1基因序列分析表明,B-19株属于呼肠孤病毒血清1型(ST1)。

关键词：牛呼肠孤病毒分离鉴定

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其体外传代遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2008年第5期30卷 329-334页

作者：刘长明危艳武张朝霞袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第4... 详细信息

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第45～60代毒价测定达107.5TCID50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞浆中;电镜观察到的病毒粒子呈圆形,直径约50nm～55nm。分离株Nsp2基因序列中第483位和535～563位氨基酸存在缺失,属PRRSV变异株。该毒株Nsp2基因序列比较发现,经细胞传40代后第3115位核苷酸处插入12个碱基序列(GAGATCGCCTTT)。用该毒株第5代培养物滴鼻接种试验猪(1.0×104.5TCID50),临床表现为持续高热(≥40.5℃,9d～12d)、食欲下降、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、体表淋巴结肿大等,发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10)。研究表明,PRRSV-HBR分离株对靶动物具有高致病力,培育的细胞适应毒株体外繁殖能力稳定,并产生了标志性基因突变,为该病毒致病机理、遗传变异规律、疫苗免疫等研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性遗传变异分析

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