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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：赵海玲刘慧芳杜艳芬司微王春来刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

本文根据胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针，建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测胎儿弯杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测胎儿弯... 详细信息

本文根据胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针，建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测胎儿弯杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测胎儿弯杆菌结果均为阳性，而非胎儿弯杆菌均为阴性;对带有SapA基因的阳性质粒的检测敏感性为108-102拷贝/μl范围内具有良好的线性关系，可敏感地检测到模板中13个拷贝的细菌DNA，其灵敏度是常规PCR方法的100倍。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。该方法为胎儿弯杆菌病的定性HE定量检测提供了有力的工具，为胎儿弯杆菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。

关键词：胎儿弯杆菌免疫学检验蛋白基因荧光PCR检测

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天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

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中国兽医科学 2019年第11期49卷 1397-1405页

作者：董志民李秀丽田向学杨春蕾燕晓翠谭世旭张万江刘思国鄢明华天津市畜牧兽医研究所天津300381 农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站天津300381 天津市畜禽健康养殖技术工程中心天津300381 天津市宁河区芦台第一中学天津301500 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌... 详细信息

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CFU/mL,最大值为5.7×10^8 CFU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CFU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。

关键词：猪链球菌9型致病性黏附能力溶血性毒力基因

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放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：倪宏波王聃赫明雷刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆 163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001

目的：构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白)，并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA，用PCR方法获得omp，克隆pGBKT7载体上，酶切鉴定及序列分析，... 详细信息

目的：构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白)，并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA，用PCR方法获得omp，克隆pGBKT7载体上，酶切鉴定及序列分析，并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果：实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论：PGBKT7-omp可压用在酵母双杂交系统中，寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质，为筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白与肺泡上皮细胞相互作用的蛋白奠定了重要基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性检测

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放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：倪宏波刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮王聃赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7... 详细信息

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用.结果:实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用.结论:pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质,为筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白与肺泡上皮细胞相互作用的蛋白奠定了重要基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性作用

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牛分枝杆菌Hsp65-ESAT6融合蛋白的表达及纯化

牛分枝杆菌Hsp65-ESAT6融合蛋白的表达及纯化

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术年会

作者：迟磊常月红云孟克赵福广刘思国宫强王春来赵昆王勇刘建东刘慧芳周媛媛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001 吉林农业大学生物技术学院长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001 吉林农业大学生物技术学院长春130118

以牛分支杆菌vallee株基因组DNA为模板,应用PCR法扩增hsp65和esat6两个基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建原核重组表达质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌感... 详细信息

以牛分支杆菌vallee株基因组DNA为模板,应用PCR法扩增hsp65和esat6两个基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建原核重组表达质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG进行诱导(终浓度1mmol/L),进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明:Hsp65-ESAT6融合蛋白是以包涵体形式表达,融合蛋白pET65-E6裂解为两部分,即58KD和30KD,两个蛋白分子量相加与预测的88KD相符,将表达的融合蛋白经Ni2+亲和层析的方法纯化.

关键词：牛分之杆菌纯化 PCR法 Hsp65基因片段 ESAT6基因片段融合蛋白

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哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：尹录杜艳芬赫明雷司微刘慧芳王春来彭玮王聃李继昌邵美丽刘思国东北农业大学哈尔滨中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室延边大学东北农业大学

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患病原菌,主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、流产、无败血症性单核细胞增多症等,尤其是免疫力低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病,是引起食物中毒的重要病... 详细信息

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患病原菌,主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、流产、无败血症性单核细胞增多症等,尤其是免疫力低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病,是引起食物中毒的重要病原菌。为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特菌的污染状况及耐药状况,在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的单核细胞增生性李斯特菌进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药性。结果从鲜肉中共分离到单核细胞增生性李斯特菌23株,检出率为14.56%,其中鲜猪肉检出率最高,这20.00%(14/70):23株分离菌株中耐药菌株为22株,耐药率高达95.65%.这表明哈尔滨市鲜肉中存在一定程度的单核细胞增生性李斯特菌污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象.应加强控制动物饲料亚治疗抗生素的使用并严格遵守休药期,防止耐药菌株产生进而控制食源性疾病的发生.

关键词：哈尔滨鲜肉单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定耐药性

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结核分枝杆菌CsdA的原核表达及免疫性分析

结核分枝杆菌CsdA的原核表达及免疫性分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：王华南亓英芳杜艳芬刘慧芳司微于申业倪洪波王春来刘思国王加明杨盛李素兰冯拥军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室新疆生产建设兵团农十师畜牧兽医站

为表达和纯化结核杆菌(MTB)冷休克蛋白CsdA,本研究根据GenBank登录的CsdA基因序列设计合成一对特异性引物,通过PCR扩增了H37Rv的CsdA基因,并将其克隆至pET-28a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为64 ku的重组蛋白。W... 详细信息

为表达和纯化结核杆菌(MTB)冷休克蛋白CsdA,本研究根据GenBank登录的CsdA基因序列设计合成一对特异性引物,通过PCR扩增了H37Rv的CsdA基因,并将其克隆至pET-28a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为64 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,表达产物能够被鼠抗CsdA血清所识别,具有良好的免疫原性。本研究为进一步研究结核分枝杆菌(MTB)CsdA的结构和功能奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 CsdA 原核表达

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禽分枝杆菌副结核亚种map0862和map2154c基因的串联重组表达及其活性

禽分枝杆菌副结核亚种map0862和map2154c基因的串联重组表达及其...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：迟磊刘思国王春来宫强赵昆刘建东王勇云孟克刘慧芳赵福广中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室吉林农业大学生命科学学院

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18基因组DNA为模版,PCR扩增出map0862和map2154c两个目的基因,采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得融合基因map0862-2154c,与原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET0862-2154c,转化到

关键词：禽分枝杆菌副结核 map2154c map0862 重组表达

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肠炎沙门氏菌三种主要毒力岛基因缺失株的构建及其免疫效力研究

肠炎沙门氏菌三种主要毒力岛基因缺失株的构建及其免疫效力研究

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第十届全国免疫学学术大会

作者：吕雪莲周薇刘松艳曹俊张童利王曼宇刘思国于申业中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院

目的 :沙门氏菌病属于重要的食源性致病菌之一,经常通过污染的水和食物引起人类疾病。沙门氏菌的致病性与其毒力岛基因密切相关。因此,构建沙门氏菌单个或多个毒力岛的基因缺失株,并评估这些毒力岛对沙门氏菌致病性的影响以及在鸡体内... 详细信息

目的 :沙门氏菌病属于重要的食源性致病菌之一,经常通过污染的水和食物引起人类疾病。沙门氏菌的致病性与其毒力岛基因密切相关。因此,构建沙门氏菌单个或多个毒力岛的基因缺失株,并评估这些毒力岛对沙门氏菌致病性的影响以及在鸡体内诱导免疫应答变化是非常重要的。方法 :本实验利用改进的Red同源重组系统成功构建SPI-1、SPI-2、SPI-3三种主要毒力岛的单缺失、双缺失及三缺失菌株。结果 :敲除SPI-1后的单缺失、双缺失和三缺失菌株的侵袭力均下降,而其他缺失菌株和野生菌株相比侵袭能力差别不大;所有缺失株对细胞的粘附力均显著低于野生菌株(P<0.001)。将上述毒力岛缺失株分别接种7日龄SPF鸡,评价缺失株的致病力、定殖能力以及对鸡只的免疫效力。结果表明,毒力岛缺失菌株可以在肝脏、脾脏和盲肠中定殖,但不会引起鸡只发病,且SM6ΔSPI-1-3在脾脏和肝脏中的定殖效率低于SM6,接种第8天即被机体迅速清除;毒力岛缺失菌株产生的抗体均处于较高水平;毒力岛缺失菌株免疫后机体CD4+T和CD8+T亚群的均有明显变化。免疫后检测血清中IL-4和IFN-γ的细胞因子水平也有上升趋势,并且病理学结果表明鸡只无明显的病理改变。结论 :毒力岛缺失菌株中SM6ΔSPI-1-3有较好的免疫效果及保护效率。三种主要毒力岛缺失菌株的成功构建为阐明肠炎沙门氏菌致病机制和研发安全有效的减毒活疫苗载体奠定了良好的基础。

关键词：肠炎沙门氏菌毒力岛免疫效力活疫苗载体

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基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建

基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：田秋丰于申业衣菲吕雪莲倪宏波刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

单核细胞增生李斯特茵的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能.为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与EGFP或DsRed基因分别插入到pET28a和pUC19载体中,构建pET-p... 详细信息

单核细胞增生李斯特茵的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能.为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与EGFP或DsRed基因分别插入到pET28a和pUC19载体中,构建pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed重组质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况.结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体茵中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达.本研究成功构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台.

关键词：单核细胞增生李斯特茵调控基因温控表达荧光蛋白载体构建

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