检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2009年第4期49卷 465-470页

作者：陈超李媛郭丹曹培丽张美晶姜海芳乔祖建王亮辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV... 详细信息

【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经PmeI线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定,用氯化铯密度梯度离心纯化试剂盒对该重组腺病毒进行纯化并确定其滴度。重组病毒经肌注、滴鼻两种途径免疫小鼠并从体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫3个方面对其免疫结果进行分析。【结果】PacⅠ酶切证实同源重组成功,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定证明了该重组腺病毒成功转录并表达了p97C末端蛋白,将该重组病毒进行纯化后滴度可达到5×1011TCID50/mL,重组病毒可诱导小鼠产生血清、肺匀浆液特异性IgG,通过滴鼻免疫方式还可诱导肺匀浆液SIgA的产生,但不能诱导特异的淋巴细胞增值。【结论】成功构建了表达p97末端基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的的体液免疫和粘膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

关键词：猪肺炎支原体猪支原体肺炎 p97基因重组腺病毒免疫效果

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌“菌影”的制备

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 674-677,693页

作者：常月红刘思国王春来刘慧芳司薇彭玮王聃赫明雷杜艳芬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点试验室/动物细菌病研究室

本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。再将含有E基因的裂解盒插入到***... 详细信息

本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。再将含有E基因的裂解盒插入到***穿梭载体pGZRS-18中,构建胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒。采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌中,含有打孔质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,升温42℃诱导E基因的表达,制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影。电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。本试验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂奠定了基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌菌影裂解基因

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牛分枝杆菌单基因及双价融合基因DNA疫苗免疫效果的研究

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中国生物工程杂志 2007年第2期27卷 47-52页

作者：宫强刘思国王春来王勇刘建东迟磊赵昆周媛媛常月红云孟克孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

利用PCR技术和SOE技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6和mpb64-esat-6融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCA、pCE6、pCH、pCM、pCAE、pCHE和pCME。转染SP2/0细胞,检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠后检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN～γ分泌情况。结果表明,7种重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著(P<0.05),其中pCA组血清抗体水平明显高于其他6种DNA疫苗免疫组(P<0.05);三免两周后,融合基因免疫组的刺激值(SI值)与单基因免疫组相比差异显著(P<0.05),其中以pCME组的SI值最高;PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN～γ高于单基因DNA疫苗组(P<0.05),而两对照组则未检测到IFN～γ的产生。成功构建了牛分枝杆菌ag85b、esat-6、hsp65、mpb64单基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6双价融合基因DNA疫苗,从而为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。

关键词：牛分枝杆菌单基因融合基因 DNA疫苗

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猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 712-717页

作者：曹培丽李媛陈超郭丹王亮乔祖建辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-29... 详细信息

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

关键词：猪肺炎霉形体 p52基因重组腺病毒免疫应答

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凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶

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分析化学 2012年第8期40卷 1225-1230页

作者：张莉丽张兰威杜明韩雪易华西张英春张艳禾马微哈尔滨工业大学食品科学与工程学院东北农业大学食品学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室

采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养基中的谷氨酰胺转胺酶,优化的凝胶层析的条件,上样量6 mL,流速为0.25 mL/min;离子交换层析的上样量50 mL,流速为3 mL/min。酶被纯化了4.22倍,比活力达17.33 U/mg蛋白,回收率为77... 详细信息

采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养基中的谷氨酰胺转胺酶,优化的凝胶层析的条件,上样量6 mL,流速为0.25 mL/min;离子交换层析的上样量50 mL,流速为3 mL/min。酶被纯化了4.22倍,比活力达17.33 U/mg蛋白,回收率为77.5%。液相色谱-串联质谱鉴定、蛋白质数据库比对结果表明,纯酶与AAN01353是同种蛋白质。

关键词：谷氨酰胺转胺酶分离纯化液相色谱-串联质谱凝胶层析离子交换层析

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牛分枝杆菌与鸟型分枝杆菌2型重组蛋白Ag85b的血清学交叉反应研究

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中国预防兽医学报 2012年第3期34卷 223-226页

作者：朱婷王华南刘慧芳于申业王秀梅陈莉苹司微赵海玲刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150000

牛分枝杆菌(***)是引起牛结核病的常见病原,而鸟分枝杆菌(***)2型则通常交叉感染牛,但不会导致严重的病变。为鉴定***和***的免疫交叉反应情况,本研究分别以***和***2型的基因组为模板,扩增ag85b基因,分别构建了***和***的原核和真核表... 详细信息

牛分枝杆菌(***)是引起牛结核病的常见病原,而鸟分枝杆菌(***)2型则通常交叉感染牛,但不会导致严重的病变。为鉴定***和***的免疫交叉反应情况,本研究分别以***和***2型的基因组为模板,扩增ag85b基因,分别构建了***和***的原核和真核表达重组质粒进行表达。以原核表达纯化的两种重组蛋白Ag85b(rAg85b)分别作为包被抗原,交叉检测两种真核重组质粒免疫豚鼠制备的抗血清。结果表明,原核表达的***和*** rAg85b与真核重组质粒免疫豚鼠制备的两种抗血清之间存在较强的免疫交叉反应。研究结果揭示***和***的Ag85b蛋白存在很强的血清学交叉反应,这将严重干扰*** Ag85b作为候选疫苗的免疫监测。

关键词：牛结核分枝杆菌鸟型分枝杆菌 ag85b基因交叉反应

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检测牛结核抗体新型ELISA方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2007年第10期29卷 810-813页

作者：郭设平刘思国王春来宫强邵美丽张秀华郭洋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用分子克隆和Splicing by overlapping extension(SOE)技术,表达了重组蛋白rM70-83-E6,Western blot分析rM70-83-E6具有很好的特异性。以蛋白rM70-83-E6作为诊断抗原建立了间接ELISA方法,ELISA诊断方法的判定标准,即S/P≥0.5为阳性,S/P<0.4为阴性,0.5>S/P≥0.4为可疑。ELISA方法的特异性为96.0%、敏感性为69.4%。对67份PPD皮试阳性和50份PPD皮试阴性(117份)血清样品进行了检测,并与PPD皮试比较。67份PPD皮试阳性血清样品中有46份为ELISA检测阳性,阳性符合率为68.7%,50份PPD皮试阴性牛血清都为阴性,阴性符合率为100%,本ELISA方法与PPD皮试诊断方法总复合率为82.1%。研究表明,ELISA方法具有很好的开发和应用前景。

关键词：融合蛋白牛结核病间接ELISA

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胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

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中国兽医科学 2008年第10期38卷 847-850页

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赵海玲赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后... 详细信息

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后血清D150nm分别由原来的0．927和0．239降低为0．196和0．078。同时,将APP1基因组DNA以Bsp143I进行酶切，回收500～2000bp的片段，与pET30a／b／c载体连接，构建了APP1基因组质粒表达文库，库容量（CFU）为2．0×10^5。用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库，从3000个菌落中获得了12个阳性克隆。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原技术菌落原位免疫杂交

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结核分枝杆菌rv0394c基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其粘附特性的鉴定

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中国预防兽医学报 2015年第3期37卷 199-202页

作者：李华芳曹俊刘松艳陈利苹刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细... 详细信息

本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细胞)互作,通过激光共聚焦显微镜观察到蛋白对细胞的特异性粘附。为进一步验证该试验结果,将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MV262中,将重组质粒电转化于非致病性的耻垢分枝杆菌中进行表达。构建的重组菌与A549细胞进行互作,结果表明重组菌可以粘附于A549细胞表面,而且这种粘附能够被RV0394c重组蛋白所阻断,这些结果表明RV0394c蛋白具有粘附细胞的能力,属于该菌的粘附蛋白之一。RV0394c蛋白粘附特性的鉴定为进一步研究该蛋白在致病性中的作用提供了实验依据。

关键词：结核分枝杆菌 rv0394c基因 pMV262 耻垢分枝杆菌粘附

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鸡肠炎沙门氏菌转座突变体库的构建及减毒菌株的筛选

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 210-213页

作者：吕爽朱婷王秀梅刘慧芳司微于申业陈利苹刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为筛选减毒肠炎沙门氏菌(***)菌株,本研究以含有Mini-Tn5转座子的重组自杀质粒pUT对*** SM6株进行转座诱变,利用双亲本滤膜杂交方法与供体菌***β2155进行接合转移,构建并优化接合转移体系,利用卡那抗性和DAP营养缺陷培养平板筛选法构建... 详细信息

为筛选减毒肠炎沙门氏菌(***)菌株,本研究以含有Mini-Tn5转座子的重组自杀质粒pUT对*** SM6株进行转座诱变,利用双亲本滤膜杂交方法与供体菌***β2155进行接合转移,构建并优化接合转移体系,利用卡那抗性和DAP营养缺陷培养平板筛选法构建了SM6的随机转座突变体库。其中包含5个子库,共计获得364株突变体,经PCR鉴定表明转座子均插入SM6株的基因组中。通过Caco-2细胞侵袭试验筛选***侵袭力减弱并在细胞内增殖受到抑制的减毒突变株,经初筛及验证最终获得3株稳定减毒菌株,为进一步研究减毒菌株突变毒力基因的定位及SM6株的侵袭及感染机制奠定了基础。

关键词：肠炎沙门氏菌转座子突变体库减毒菌株

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