检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 90-93页

作者：李媛乔祖健王亮张建华辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PG1的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32... 详细信息

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PG1的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100%,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白,Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。

关键词：牛传染性胸膜肺炎(CBPP) 丝状支原体丝状亚种SC(MmmSC) LppC

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猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 169-173页

作者：李媛张建华王亮乔祖建辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。

关键词：猪肺炎支原体猪喘气病伴侣蛋白DnaK 热休克蛋白70

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库的构建及对小鼠的免疫保护作用研究

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 153-156页

作者：刘慧芳周媛媛刘思国宫强王勇刘建东王春来常月红迟磊赵昆云孟克中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA,回收500bp～3000bp的片段,插入到真核表达载体pCDNA3.1(+)的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒,电转化大肠杆菌TG1,获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库(大约含有106个... 详细信息

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA,回收500bp～3000bp的片段,插入到真核表达载体pCDNA3.1(+)的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒,电转化大肠杆菌TG1,获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库(大约含有106个克隆)。将该文库随机分为10个亚文库(10个Clone pool),分别提取每个亚文库的重组质粒免疫小鼠(n=130只),免疫剂量为100μg,免疫3次后以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒,通过相对保护率、肺组织荷菌数、病理组织学3个指标测定其对小鼠的免疫保护作用。试验结果表明,Clone pool3、Clone pool2、Clone pool6和Clone pool7的免疫效果明显优于其他免疫组,尤其是Clone pool3的免疫保护效果最佳。本研究成功构建了7型胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库,从而为筛选和获得新的保护性抗原基因奠定基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库构建保护作用

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利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

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黑龙江畜牧兽医 2011年第8期 28-30页

作者：司微刘慧芳王春来彭玮赫明雷杜艳芬赵海玲王聃杨金国林靖凯倪洪波刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒p... 详细信息

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。

关键词： Red重组系统 ClpP基因基因敲除

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一株山羊支原体山羊肺炎亚种的分离鉴定与分子特征

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中国预防兽医学报 2007年第4期29卷 243-248页

作者：辛九庆李媛张建华胡守萍王亮中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础条件及技术服务中心黑龙江哈尔滨150001

从送检的山羊肺炎肺脏中成功分离到一株支原体,经过3次克隆纯化后进行生化试验、电镜观察、PCR及酶切、基因特征鉴定,结果显示分离物SD3属于山羊支原体山羊肺炎亚种成员。将培养物经气管接种2只山羊可引起1只山羊典型发病,体温升高至41.... 详细信息

从送检的山羊肺炎肺脏中成功分离到一株支原体,经过3次克隆纯化后进行生化试验、电镜观察、PCR及酶切、基因特征鉴定,结果显示分离物SD3属于山羊支原体山羊肺炎亚种成员。将培养物经气管接种2只山羊可引起1只山羊典型发病,体温升高至41.5℃,IgG和IgM抗体效价明显升高,其中IgG抗体变化与临床表现基本同步。剖检发现肺脏发生严重病变,并从中再次分离到该病原体。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种分离基因特征鉴定

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牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大肠杆菌中的过表达,纯化及抑菌活性

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中国生物工程杂志 2007年第3期27卷 65-70页

作者：赵昆刘思国王春来宫强迟磊刘建东王勇云孟克常月红刘慧芳周媛媛孙延鸣中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001 石河子大学石河子832003

牛抗菌肽Bac7和Bac5是一种线性阳离子小分子多肽,在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组... 详细信息

牛抗菌肽Bac7和Bac5是一种线性阳离子小分子多肽,在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于*** BL21(DE3)中实现了重组蛋白B7-B5(rB7-B5)的过表达,表达的rB7-B5以包涵体形式存在,rB7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6%,分子量大小为33kDa,与预测大小相符。以8mol/L尿素变性包含体后用Ni亲和层析柱纯化目的蛋白,经多步透析法复性的rB7-B5对猪胸膜肺炎放线杆菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性,为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。

关键词：牛抗菌肽Bac7和Bac5 融合基因重组表达抑菌活性

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哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国预防兽医学报 2009年第12期31卷 929-932页

作者：尹录杜艳芬赫明雷司微刘慧芳王春来彭玮王聃李继昌邵美丽刘思国东北农业大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室延边大学

为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特菌(Lm)的污染状况及耐药状况。在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉样品,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的Lm进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药... 详细信息

为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特菌(Lm)的污染状况及耐药状况。在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉样品,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的Lm进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药性。结果从鲜肉中共分离到Lm23株,检出率为14.56%,其中鲜猪肉检出率最高,达20.00%(14/70);23株分离菌株中耐药菌株为22株,耐药率高达95.65%。这表明哈尔滨市鲜肉中存在一定程度的Lm污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象。应加强控制动物饲料亚治疗抗生素的使用并严格遵守休药期,防止耐药菌株产生进而控制食源性疾病的发生。

关键词：哈尔滨鲜肉单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定耐药性

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结核分枝杆菌rv0199基因在耻垢分枝杆菌中的表达及检测

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中国畜牧兽医 2014年第7期41卷 9-13页

作者：崔保亮陈利苹张娈娈李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重... 详细信息

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗StrepⅡ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测***的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv0199基因 pMV261 pMV262 耻垢分枝杆菌

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结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定

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畜牧与兽医 2014年第10期46卷 1-5页

作者：张娈娈陈利苹曹俊崔保亮李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES... 详细信息

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。

关键词： Rv3802c蛋白 pC3.1-3LHF-Red重组质粒内部核糖体进入位点(IRES) CHO细胞

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牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果

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中国兽医学报 2009年第2期29卷 134-138页

作者：宫强刘思国王春来刘慧芳刘建东施远祥阿曼古丽孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆动物防疫监督总站新疆乌鲁木齐830063

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗。以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况。结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05)。二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05)。

关键词：牛分枝杆菌融合DNA疫苗组合DNA疫苗

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