检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2009年第5期39卷 416-420页

作者：李媛董惠张美晶陈超曹培丽郭丹姜海芳辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室黑龙江哈尔滨150001

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法,并对该方法进行了敏感性和特异性试验。该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体... 详细信息

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法,并对该方法进行了敏感性和特异性试验。该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(***)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性。利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法。

关键词：牛霉形体牛传染性胸膜肺炎聚合酶链式反应

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牛支原体免疫相关性蛋白硫锌酰胺脱氢酶的筛选与鉴定

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中国预防兽医学报 2012年第10期34卷 761-765页

作者：孙文静李媛宋志强邹晓辉刘洋陈维周玉梅张秀英辛九庆东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定牛支原体(***)菌体免疫相关蛋白及其免疫原性,本实验以***湖北株为样品,通过建立***全菌蛋白的双向电泳体系,获得了分辨率及重复性良好的双向电泳(2-DE)图谱。利用western blot技术进行筛选,鉴定得到多个***蛋白,其中一个分子量为... 详细信息

为鉴定牛支原体(***)菌体免疫相关蛋白及其免疫原性,本实验以***湖北株为样品,通过建立***全菌蛋白的双向电泳体系,获得了分辨率及重复性良好的双向电泳(2-DE)图谱。利用western blot技术进行筛选,鉴定得到多个***蛋白,其中一个分子量为68 ku,经过质谱分析和氨基酸一级结构比对确定该蛋白为硫锌酰胺脱氢酶(LipDH)。经原核重组表达,LipDH重组蛋白与***阳性血清的western blot反应为阴性,而Dot blot及以重组表达蛋白作为包被抗原的ELISA鉴定结果均为阳性。本研究为进一步研究LipDH的功能以及采用其重组蛋白用于该蛋白缺失的***疫苗株的鉴别检测方法的建立奠定了基础。

关键词：牛支原体双向电泳免疫质谱

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8株牛支原体分离株P81表面膜蛋白基因的克隆与序列分析

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中国预防兽医学报 2010年第3期32卷 232-234页

作者：董慧辛九庆李媛陈维刘洋张美晶姜海芳刘云东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究对我国采集自8个省份患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原分离鉴定,得到8株牛支原体(***)分离株。参考GenBank中已发表的***45株的P81基因序列,设计引物扩增P81基因,将其克隆到pMD-18T上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及... 详细信息

本研究对我国采集自8个省份患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原分离鉴定,得到8株牛支原体(***)分离株。参考GenBank中已发表的***45株的P81基因序列,设计引物扩增P81基因,将其克隆到pMD-18T上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及分析。结果显示,P81基因全长2097bp,含有1个开放性阅读框,编码699个氨基酸。这8株***分离株的P81同源性为99.4%～99.9%,与PG45株同源性94.6%～94.9%,与无乳支原体(***)PG2株同源性仅为73.8%～74%,结果表明,***81基因基因高度保守,种间差异较大,具有研究前景。

关键词：牛支原体 P81基因序列分析

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猪链球菌2型SSU05-1311蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2016年第3期46卷 310-314页

作者：杨宝玲陈福广谢芳刘思国沈国顺张跃灵沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110866 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

以猪链球菌2型菌株05ZYH 33的基因组作为模板,PCR扩增SSU 05-1311(简称ssFbp)基因,克隆到表达载体pET22b中,构建重组质粒pET22b-ssFbp。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达SsFbp蛋白,并通过亲和层析纯化。纯化的SsFbp... 详细信息

以猪链球菌2型菌株05ZYH 33的基因组作为模板,PCR扩增SSU 05-1311(简称ssFbp)基因,克隆到表达载体pET22b中,构建重组质粒pET22b-ssFbp。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达SsFbp蛋白,并通过亲和层析纯化。纯化的SsFbp蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体。结果显示,Ss Fbp蛋白以可溶形式表达,分子质量大小为112ku。每升培养物获得SsFbp重组蛋白20 mg,纯度大于95%。免疫筛选后获得了ss Fbp蛋白的多克隆抗体。Western-blot结果显示,多克隆抗体能特异识别05ZYH33细胞壁蛋白组分中的SsFbp蛋白。本研究为进一步研究SsFbp蛋白的功能及其在致病性中的作用奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型 SsFbp蛋白表达和纯化多克隆抗体

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结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国预防兽医学报 2013年第8期35卷 684-686页

作者：曹俊陈利苹刘银冰鄢秋龙刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

为制备结核分枝杆菌(Mtb)rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白... 详细信息

为制备结核分枝杆菌(Mtb)rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白。将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE和westernblot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性。以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv3036c基因原核表达多克隆抗体

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大肠杆菌“菌影”的制备

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东北农业大学学报 2009年第6期40卷 85-88页

作者：彭玮王聃刘思国常月红王春来刘慧芳司薇赫明雷杜艳芬东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有PR/cI启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建溶菌质粒pBV-E。采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),含有裂... 详细信息

通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有PR/cI启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建溶菌质粒pBV-E。采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),含有裂解质粒的大肠杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,然后升温到42℃诱导其溶解,制成了大肠杆菌菌影。电镜观察发现菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。

关键词：大肠杆菌菌影裂解基因E

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结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

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中国兽医科学 2011年第7期41卷 697-700页

作者：王华南亓英芳朱婷于申业刘慧芳司微杨盛王加明冯拥军李素兰于秀婷王春来刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆生产建设兵团农十师畜牧兽医站新疆阿勒泰836000

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 pdhA基因原核表达

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结核分枝杆菌csdA基因的原核表达及其免疫原性

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中国兽医科学 2010年第12期40卷 1232-1235页

作者：王华南亓英芳杜艳芬刘慧芳司微于申业王加明杨盛李素兰冯拥军倪洪波王春来刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆生产建设兵团农十师畜牧兽医站新疆阿勒泰836000

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 690 bp的csdA(cold-shock dead-box protein A)基因,经限制性酶切后,与pET28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中后,重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导表达了csdA蛋白及Ni-His-resin纯化蛋白,经Western-blot分析,鉴定了目的蛋白的反应原性。试验结果表明,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在64 ku处获得一目的条带,具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-csdA,获得了高纯度的重组蛋白,为深入研究csdA蛋白的功能奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 csdA基因原核表达

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通过改进Red重组方法快速构建肠炎沙门菌毒力岛SPI-1缺失株

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中国预防兽医学报 2014年第11期36卷 852-855页

作者：吕雪莲于申业倪宏波衣菲田秋丰刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

沙门菌依赖毒力岛SPI-1编码的Ⅲ型分泌系统在侵染宿主肠道上皮细胞中起重要作用。为制备沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,本研究利用PCR扩增毒力岛SPI-1上下游同源臂和含有氯霉素抗性基因片段,连接p ET-28a构建打靶质粒,采用电击法将其转入含有... 详细信息

沙门菌依赖毒力岛SPI-1编码的Ⅲ型分泌系统在侵染宿主肠道上皮细胞中起重要作用。为制备沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,本研究利用PCR扩增毒力岛SPI-1上下游同源臂和含有氯霉素抗性基因片段,连接p ET-28a构建打靶质粒,采用电击法将其转入含有p KD46a质粒的肠炎沙门菌中。经L-阿拉伯糖诱导同源重组后,鉴定阳性重组子,转化诱导产生重组酶FLp的p CP20质粒,从而删除氯霉素抗性基因,通过PCR方法鉴定缺失株,命名为SM6ΔSPI-1。连续培养鉴定表明缺失株具有良好的遗传稳定性。生长特性研究显示缺失株生长速率高于野生菌株。本研究利用改进的Red重组系统通过一步法构建了肠炎沙门菌毒力岛SPI-1缺失株,为沙门菌毒力岛的功能研究与基因工程减毒疫苗研制奠定了基础。

关键词：毒力岛SPI-1 Red同源重组缺失株

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牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat6融合基因的分子克隆及表达

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中国预防兽医学报 2007年第8期29卷 588-590页

作者：迟磊刘思国王春来宫强赵昆王勇刘建东云孟克赵福广中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学生物技术学院吉林长春130118

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a(+)中获得重组质粒pET64-85... 详细信息

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a(+)中获得重组质粒pET64-85b-e6。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)进行诱导,SDS-PAGE电泳分析表达情况,以Ni^(21)亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western blot分析融合蛋白的免疫活性。结果表明:表达的融合蛋白大约为76 Ku,与预测大小相符,以Ni^(21)亲和层析柱纯化的融合蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应。

关键词：牛分枝杆菌融合基因重组表达

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