检索结果-内蒙古大学图书馆

2016-2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析

中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1947-1958页

作者：龙凤谢守玉崔鹏飞施开创韦显凯冯淑萍屈素洁陆文俊李剑锋尹彦文邓国华广西动物疫病预防控制中心南宁530001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业农村部动物流感重点实验室哈尔滨150069 崇左市动物疫病预防控制中心崇左532200

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3600份,接种... 详细信息

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3600份,接种9~11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%~99.88%和93.13%~99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%~99.1%和94.6%~99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为83.9%~98.2%和86.1%~98.2%,表明HA基因较NA基因更为保守;与同期的参考毒株相似性高于早期,表明毒株存在持续进化。遗传进化分析结果显示,广西毒株的HA、NA基因属于当前优势流行的G57基因型分支,与疫苗株遗传关系较远。进化速率估算结果显示,HA、NA基因的平均进化速率分别为3.99×10^(-3)和4.59×10^(-3)替换/位点/年,最近共同祖先估算时间(tMRCA)分别为66.77和58.24年,表明HA基因比NA基因进化缓慢。重组分析结果显示,从鸡、鸭及环境中各分离到的毒株HA基因存在重组现象,主要亲本和次要亲本毒株均为人源的A/Beijing/1/2017株和禽源的A/quail/Hainan/250/2012株。【结论】当前H9亚型AIV广西流行毒株HA、NA基因与越南及国内省份的毒株相似性较高,具有遗传多样性特征,进化趋势以G57为优势基因型,与人源流感毒株发生基因重组,为新型流感产生创造条件。

关键词： H9亚型禽流感病毒遗传变异进化动态

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马耳他布鲁氏菌M5-90 L31基因缺失株的安全性和免疫原性评估

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中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1196-1200,1223页

作者：张慧桐赵键龙隆力扬许达姜丽英步志高胡森中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/重要人兽共患病及烈性外来病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了评估布鲁氏菌M5-90 L31基因缺失株(M5-90ΔL31)的安全性与免疫原性,本研究以小鼠为动物模型,测定M5-90ΔL31在CD-1小鼠体内的复制水平,结果显示M5-90ΔL31在小鼠脾脏中的复制水平较亲本株M5-90降低了3.02log,安全性提高;将接种和不... 详细信息

为了评估布鲁氏菌M5-90 L31基因缺失株(M5-90ΔL31)的安全性与免疫原性,本研究以小鼠为动物模型,测定M5-90ΔL31在CD-1小鼠体内的复制水平,结果显示M5-90ΔL31在小鼠脾脏中的复制水平较亲本株M5-90降低了3.02log,安全性提高;将接种和不接种M5-90ΔL31的CD-1小鼠同居饲养30 d后,采集各组小鼠脾脏经菌落计数检测该菌株水平传播能力,结果显示,接种M5-90ΔL31小鼠均可分离到该菌或虎红平板凝集试验检测为阳性,而未接种小鼠则未检测到该菌,未发生水平传播;分别于CD-1小鼠皮下接种M5-90ΔL31和M5-90菌株并测定半数康复时间(RT50)和免疫保护力,结果显示,接种M5-90ΔL31组小鼠RT50为4.47±1.92周。攻毒后M5-90ΔL31组小鼠在45 d和150 d保护单位分别为3.62和2.81,与M5-90组差异不显著。进一步利用豚鼠进行安全性试验和攻毒保护试验,结果显示:M5-90ΔL31组豚鼠脾脏菌载量为67 cfu/g,M5-90株豚鼠脾脏菌载量为1 268cfu/g,二者差异显著;M5-90ΔL31与亲本株M5-90均可抵抗强毒株M28对豚鼠的感染。本研究结果首次表明M5-90ΔL31具有良好的安全性和免疫原性,为新一代更安全的布鲁氏菌疫苗候选株筛选奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌 L31 小鼠豚鼠安全性与免疫原性

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非洲猪瘟病毒免疫逃逸分子机制研究进展

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2074-2082页

作者：赵旭阳靳家鑫路闻龙张帅黄丽张改平孙爱军庄国庆河南农业大学动物医学院国家动物免疫学国际联合研究中心郑州450046 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,至今没有研发出安全有效的疫苗,一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中,通过抑... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,至今没有研发出安全有效的疫苗,一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中,通过抑制干扰素和炎症反应,调节凋亡、自噬及细胞免疫等多种途径逃逸机体免疫反应促进自身复制,但具体的机制仍不完全清楚。ASFV复杂的免疫逃逸机制可能是阻碍有效疫苗研发的关键因素之一。借助生物信息学技术对ASFV的基因组和蛋白质组深入分析,筛选病毒的免疫调控关键基因和保护性抗原表位,将在ASFV免疫逃逸分子机制的研究与疫苗研发中发挥重要作用。本文主要对ASFV感染引起的免疫应答反应及可能的免疫逃逸机制研究进行概述,以期为ASF疫苗研制及综合防控提供思路。

关键词：非洲猪瘟非洲猪瘟病毒免疫应答免疫逃逸疫苗研发

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北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫层析试纸条的研制及初步应用

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中国预防兽医学报 2022年第8期44卷 842-849页

作者：李宛生李敏华张洪亮李超许浒付军龚帮俊郭镇洋刘建波彭金美周国辉王倩田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 北京爱德士元亨生物科技有限公司北京101318

为研制一种快速检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的免疫层析试纸条(ICS),本研究以红色乳胶微球偶联的PRRSV N蛋白单克隆抗体(MAb)1H4为检测抗体,并包被在结合垫上,以MAb 1H4和羊抗鼠IgG为捕获抗体,并分别包被在硝酸纤维素膜上... 详细信息

为研制一种快速检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的免疫层析试纸条(ICS),本研究以红色乳胶微球偶联的PRRSV N蛋白单克隆抗体(MAb)1H4为检测抗体,并包被在结合垫上,以MAb 1H4和羊抗鼠IgG为捕获抗体,并分别包被在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,经各反应条件的优化建立了检测PRRSV的乳胶微球ICS。各反应条件优化结果显示,乳胶微球偶联的MAb即检测抗体浓度为1.5 mg/mL,检测线MAb即检测线捕获抗体的浓度为2.0 mg/mL,质控线羊抗鼠IgG即质控线捕获抗体的浓度为1.0 mg/mL。特异性试验结果显示,该方法可特异性检测我国出现的高致病性、NADC30-like、NADC34-like等北美型PRRSV代表株,与欧洲型PRRSV DV疫苗株及猪的其他常见病毒(CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PPV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对系列稀释PRRSV(10^(5.0) TCID_(50)/mL~2.5×10^(2.0) TCID_(50)/mL)的最低检测限为5×10^(2.0) TCID_(50)/mL,对2倍倍比稀释的重组N蛋白(rN,24000 ng/mL~3.75 ng/mL)的最低检测限为15 ng/mL;重复性试验结果显示,同一批次和不同批次试纸条的检测结果均无差异;对不同类型北美型PRRSV株(高致病性株、NADC30-like株、类高致病性株)感染的猪血清检测结果显示,利用该ICS可以从相应猪血清中检测到不同北美型的PRRSV。对采集的108份疑似PRRSV感染的猪肺组织及血清样品分别采用本研究建立的ICS及本研究室建立的PCR方法检测,结果显示,ICS检测的阳性率为37.03%(40/108),PCR检测的阳性率为42.59%(46/108),二者的总体符合率为83.33%。上述结果表明,该方法可以用于我国PRRSV主要流行株及临床样品的检测。本研究首次以同一株MAb分别作为检测抗体和检测线捕获抗体,建立检测PRRSV的乳胶微球ICS,为现地PRRSV流行病学调查及临床快速检测提供了新的技术手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型 N蛋白免疫层析试纸条

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基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 162-168页

作者：纪玉洁郭兴张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(... 详细信息

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×10^(5)~1:6.4×10^(4),分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株MAb,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

关键词： B型流感病毒 RNA依赖性RNA聚合酶 ANP32蛋白单克隆抗体

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杯状病毒疫苗免疫猫中杯状病毒分离株的遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 555-559,571页

作者：郑亚婷刘迪许鑫燕杨育鹏康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为了解猫杯状病毒(FCV)疫苗免疫猫中FCV的感染情况及分子特征,本研究随机采集哈尔滨和大连经灭活疫苗免疫的猫口腔拭子样品29份,从中分离鉴定获得8株FCV,对分离到的病毒进行全基因组测序及同源性与遗传进化分析。全基因组序列同源性分... 详细信息

为了解猫杯状病毒(FCV)疫苗免疫猫中FCV的感染情况及分子特征,本研究随机采集哈尔滨和大连经灭活疫苗免疫的猫口腔拭子样品29份,从中分离鉴定获得8株FCV,对分离到的病毒进行全基因组测序及同源性与遗传进化分析。全基因组序列同源性分析结果显示:8株分离病毒与国内FCV参考株的核苷酸同源性为76.1%~89.3%,与国外FCV参考株的同源性为77.1%~83.5%;8株FCV间的同源性为76.9%~97.9%,DL31株与DL37株的同源性高达97.9%;与疫苗株F4、F9、F65、255相比,8株分离病毒与其同源性在76.2%~79.8%。VP1和全基因组序列遗传进化分析显示:34株FCV可以分为2个大分支,即基因群Ⅰ和Ⅱ,8株分离病毒在两个基因群均有分布,其中分离株HRB46与韩国株12Q087-1处于同一分支,但8株FCV与疫苗株F4、F9、F65、255等均不在一个分支。将分离病毒VP1重要氨基酸位点与传统疫苗株F9比较分析,结果显示:其D区和conE区的氨基酸相对保守,但其5’高变区(5’HVR)与3’HVR的变异较大,而已有研究发现疫苗株F9在E区5’HVR的Asn-GlyThr序列(aa439~aa441)具有较强的免疫原性,8株分离株在该位点发生了1aa~3aa变异;部分B细胞抗原表位中的氨基酸也发生了突变,8株FCV在aa448~aa450这3个位点发生了连续性变异。以上结果表明FCV具有高度的遗传变异性,由此可能造成FCV疫苗免疫失败。本研究首次对FCV疫苗免疫猫开展FCV的分离鉴定,并分析了分离株与疫苗株的差异,为FCV感染的防控和疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猫杯状病毒疫苗全基因组遗传进化

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检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

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中国兽医学报 2022年第1期42卷 53-60页

作者：刘迪郑亚婷许鑫燕董丽丽康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10;拷贝/μL... 详细信息

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10;拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%~0.71%,组间变异系数为0.05%~0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。

关键词：猫杯状病毒实时荧光定量RT-PCR SYBR GreenⅠ ORF1

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SFTSV实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 292-297页

作者：于志亚杨鸣发马云云康洪涛姜骞刘家森李广兴曲连东东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。当质粒标准品浓度为4.22×10^(2)~4.22×10^(9)copies/μL时,荧光定量标准曲线C;值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.9998。该方法对发热伴血小板减少综合征病毒最低检测限为4.22×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍;该方法可特异性地检测出SFTSV,而对同科其他病毒检测结果均为阴性;批内、批间变异系数均小于2%。对采集的200只蜱进行检测,阳性检出率为3.5%,而常规RT-PCR方法的阳性检出率为2%。研究结果表明,本研究建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,为发热伴血小板减少综合征的检测提供了技术手段。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR

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副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 331-338页

作者：王建国陈凡若鹿萍臧鑫鑫党光辉姜艳艳崔宁冯婷婷张嘉俊王慧崔莹莹崔子寅刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 辽宁中医药大学辽宁沈阳110847

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶... 详细信息

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。

关键词：副结核分枝杆菌 GDSL脂肪酶 MAP_2739 酶学特性

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宿主细胞转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 119-125页

作者：马官芹王岩林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程... 详细信息

转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2^(KO)细胞。将EIAV感染性克隆CMV_(3-8)及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2^(KO)细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制。western blot结果显示,与CMV_(3-8)转染的HEK293T细胞相比,转染CMV_(3-8)的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2^(KO)细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强。进一步表明,敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染。以上结果表明,Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系,可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响,本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。本研究构建的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具。

关键词： Nrf2 CRISPR/Cas9 敲除细胞系马传染性贫血病毒

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